научная статья по теме АНТИМОДИФИКАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ ARDA И OCR Биология

Текст научной статьи на тему «АНТИМОДИФИКАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ ARDA И OCR»

ГЕНЕТИКА, 2011, том 47, № 2, с. 159-167

= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

УДК 577.21

АНТИМОДИФИКАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ ArdA И Ocr © 2011 г. Г. Б. Завильгельский, В. Ю. Котова, С. М. Расторгуев

Федеральное государственное унитарное предприятие Научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 117545; e-mail: zavilgel@genetika.ru Поступила в редакцию 08.02.2010 г.

Антирестрикционные белки ArdA и Ocr, гены которых расположены в конъюгативных плазмидах (ardA) и в геномах бактериофагов (0.3 (ocr)), специфически ингибируют ферменты рестрикции-модификации типа I. В настоящей работе показано, что белок Ocr (бактериофаг Т7) в широком диапазоне внутриклеточной концентрации (начиная с 10-20 молекул на клетку) ингибирует одновременно как рестрикционную (эндонуклеазную), так и модификационную (метилазную) активности фермента EcoKI. В отличие от Ocr белок ArdA (конъюгативная плазмида ColIb-P9) ингибирует одновременно обе активности EcoKI лишь при высокой внутриклеточной концентрации (более 30000-40000 молекул на клетку). При снижении концентрации в несколько раз ArdA ингибирует лишь эндонуклеазную активность EcoKI. Предполагается, что пониженная способность ингибиро-вать модификационную активность ферментов EcoKI у белков ArdA связана со значительным различием в жизненном цикле конъюгативных плазмид (симбиоз с бактериальной клеткой) и бактериофагов (заражение и лизис бактерий). Получены мутантные формы белков Ocr и ArdA, ингибиру-ющие исключительно эндонуклеазную активность EcoKI. Предполагается, что антирестрикционные белки, потерявшие способность формировать гомодимеры, ингибируют лишь эндонуклеазную активность ферментов рестрикции-модификации типа I.

Гены ardA (alleviation of restriction of DNA) ответственны за синтез небольших по размеру (160—170 аминокислотных остатков), очень кислых (суммарный заряд — 25: —30) антирестрикци-онных белков ArdA [1—7]. Расположены гены ardA в лидерной области конъюгативных плазмид и одними из первых входят в клетку-реципиент при конъюгативном переносе ДНК [1, 3, 6, 7]. Геном бактериофага Т7 содержит ген 0.3 (ocr), кодирующий антирестрикционный белок Ocr, однако он не гомологичен белкам семейства ArdA и значительно короче (116 аминокислотных остатков) [8—10]. Антирестрикционные белки, или антире-стриктазы ArdA и Ocr, ингибируют лишь ферменты АТФ-зависимой системы рестрикции—модификации типа I. Пространственная структура этих белков подобна биспиральной ДНК в B-форме и, следовательно, ArdA и Ocr относятся к семейству ДНК-мимикрирующих белков (protein mimicry of DNA) [11-13].

Гены ardA помогают плазмидам преодолевать межклеточные "рестрикционнные барьеры" и тем самым способствуют "горизонтальному" переносу генов между бактериальными клетками разных видов и родов [7, 14-16]. Ген 0.3 (ocr) фага Т7, кодирующий белок Ocr, который ингибирует клеточные рестриктазы, значительно повышает способность фага инфицировать различные штаммы бактерий [8, 9].

Ранее было показано, что антирестрикционные белки АгёА (конъюгативные плазмиды рКМ101 (тсМ), Со11Ь-Р9 (тс11)) и Осг (бактериофаг Т7) практически полностью ингибируют активность клеточных ферментов рестрикции-модификации типа I, если гены, кодирующие эти белки, расположены в мультикопийном векторе серии риС под /ас-промотором, причем одновременно ингибируются как рестрикционная (эндо-нуклеазная), так и модификационная (метилаз-ная) активности ферментов [4, 17-19].

Однако в связи со значительным различием в жизненном цикле конъюгативных плазмид (симбиоз с бактериальной клеткой) и бактериофагов (заражение и лизис бактерий) представляло интерес сравнить эффективности ингибирующего действия этих белков. Можно предположить, что при фаговой инфекции (в клетку входит двухтя-жевая ДНК, чувствительная к рестриктазам) белок Осг должен немедленно, т.е. уже при сравнительно низких концентрациях, ингибировать клеточные ферменты рестрикции-модификации. При конъюгативном переносе ДНК входит в клетку-реципиент в однотяжевой форме, резистентной к действию рестриктаз (репликация ДНК происходит согласно модели "катящейся катушки"), что дает возможность накопить достаточное количество белка АгёА, необходимое для

ингибирования клеточных рестриктаз к моменту превращения ДНК в двухтяжевую форму.

Проведенная нами оценка констант диссоциации Kd, характеризующих взаимодействие белков Ocr и ArdA с ферментом рестрикции-модификации EcoKI (тип I), показала, что Kd Ocr примерно в 1000 раз меньше Kd ArdA: 10-10 и 10-7 M соответственно [19]. Приблизительный расчет количества молекул антирестриктаз, необходимых для полного ингибирования ферментов EcoKI в бактериальной клетке, дает следующие цифры: 1020 молекул Ocr против 10000-20000 ArdA.

Однако оставался открытым вопрос об условиях, необходимых для ингибирования модифика-ционной (метилазной) активности ферментов рестрикции-модификации типа I белками Ocr и ArdA.

В настоящей работе проведено измерение ан-тимодификационной активности у белков Ocr и ArdA в зависимости от их внутриклеточной концентрации, а также от наличия в полипептидных цепях различных аминокислотных замещений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, бактериофаги и плаз-миды. В работе использовали штаммы E. coli K-12: JM109 recA1 endA1 gyrA96 thi supE44 relA1 hsdR17 Alac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZAM15]; TG-1 thi relA supE44 hsdR17hsdMMac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ AM15]; AB1157 F-, thr-1, leu-6, proA2, his-4, thi-1, argE3, lacY1, galK2, ara14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL31, supE44, r+m+; MG1655 Z1 - содержит в составе хромосомы ген, кодирующий TetR, белок-репрессор промотора PtetA. Штамм E. coli MG1655Z1 был получен трансдукцией с помощью фага P1vir согласно [20]; в качестве донора использовали E. coli DH5aZ1 tetR, в геноме которого ген tetR тесно (90% котрансдукции) сцеплен с геном, определяющим резистентность бактерии к спектиномицину. Все используемые штаммы получены из коллекции ГосНИИгенетика.

Бактериофаг ^vir получен от Р. Деворе, Франция. В работе приняли немодифицированные фаги X.0 и модифицированные фаги X.K, выращенные на E. coli TG-1 и E. coli K-12 AB1157 соответственно.

В работе использовали векторы pBR322, pUC18, pTZ57R. В качестве векторов, содержащих строго регулируемый промотор, использовали векторы серии pZ с репликонами ColE1 (pZE21 Knr) и pSC101 (pZS33 Cmr): копийность векторов составляет 60-70 и 8-10 копий на клетку соответственно [21]. В качестве строго регулируемой промоторной-операторной области в данные векторы встроен фрагмент ДНК, содержащий PltetO-1. Промотор PitetO- 1 состоит из промоторной части Pl из генома фага X и из опе-

раторной части tetO2 из регуляторной области оперона тетрациклин-резистентности транспозо-на Tn10. Векторы pZE21 Knr и pZS33 Cmr содержат также последовательность Шайна-Дальгар-но (RBS) и полилинкер, служащий для встраивания фрагмента ДНК с исследуемым геном.

В работе использовали сконструированные нами ранее гибридные плазмиды pZS33-lux и pZE21-lux, содержащие гены luxCDABE Photorhab-dus luminescens под промотором PitetO-1 [10].

Cреды, ферменты, реактивы. Состав использованных сред и концентрации добавок приведены в работе [18]. В опытах с клонированием использовали L-бульон и L-агар. Реакции расщепления и лигирования проводили с использованием ферментов фирмы "Fermentas" (Литва).

Конструирование плазмид. В качестве источника гена ardA использовали конъюгативную плаз-миду ColIb-P9 (incI1), в качестве источника гена 0.3(ocr) — ДНК бактериофага Т7. Для клонирования генов ardA ColIb-P9 и 0.3(ocr) T7 использовали специфические праймеры с последующим накоплением продуктов с помощью ПЦР

С вектором pBR322 использовали плазмиду pVK6 c встроенным в нее геном ardA ColIb-P9 [3]. Эндонуклеазное расщепление, лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля, ПЦР-амплификацию и клонирование проводили согласно [22]. Трансформацию клеток E. coli проводили электропорацией. С помощью универсальных прямого и обратного праймеров определяли нуклеотидную последовательность клонированных фрагментов. Последовательность нуклеотидов определяли по методу Сэнгера [23].

Для клонирования гена ardA ColIb-P9 использовали в качестве праймеров следующие олиго-нуклеотиды с последующим накоплением продуктов с помощью ПЦР:

BamHI

ardA-Ndir 5'-ctgggatccgggaatgtctgttgttgc-3', PstI

ardA-Nrev 5'-cattctgcagcgggggagtaaatcaccg-3'.

Для клонирования гена 0.3 (ocr) T7 использовали в качестве праймеров следующие олигонук-леотиды ocr-Ndir и ocr-Nrev:

BamHI

ocr-Ndir 5 '-ttatgggatccactaataactgcac-3', HindIII

ocr-Nrev 5 '-cgctattgaagcttggtagtagac-3'.

Полученные ПЦР-амплификацией фрагменты ДНК клонировали в векторе pTZ57R и затем в pUC18.

На втором этапе гены ardA и 0.3(ocr) переклонировали в векторы pZE21 и pZS33 под контроль

Таблица 1. Влияние белков ArdA (ColIb-P9) и Ocr (бактериофаг T7) на Eco KI-рестрикцию и EcoKI-модификацию в E. coli K12 AB1157 r+m+ и JM109 r-m+* при условии клонирования соответствующих генов ardA и 0.3(ocr) в векторах pBR322 и pUC18

Плазмида Белок Коэффициент рестрикции (K) фага 1.0 на AB1157 r+m+** Коэффициент рестрикции (K) фага 1jm109 на AB1157 r+m+

pBR322 Отсутствует 2.0 х 10-4 1

pUC18 Отсутствует 2.0 х 10-4 1

pVK6 (pBR322) ArdA 1 1

pSR3 (pUC18) ArdA 1 2.0 х 10-4

pSR8 (pUC18) Ocr 1 2.0 х 10-4

* Фагом Х.0 заражали клетки штамма E. coli JM109 r m+ и после проведения одиночного цикла размножения полученный фаголи-зат (в таблице обозначен как Ajml09) титровали на штаммах TG-1 и AB1157.

** Коэффициент рестрикции (K) определяли отношением титра фага Х.0 (третий столбец) и ^¡м109 (четвертый столбец) на штамме AB1157 к титру этого фага на штамме TG-1 r-m-.

строго регулируемого промотора РцеЮ-1. Встраивание фрагментов ДНК в векторы проводили по сайтам KpnI и HindIII.

Сконструированные таким образом гибридные плазмиды вводили путем трансформации в клетки штамма E. coli MG1655Z1, содержащего в геноме ген, кодирующий репрессор TetR. В качестве индуктора транскрипции промотора P[teto-1 использовали производное тетрацикли

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»