БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 152-157
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3
АНТИНИТРОЗАТИВНАЯ СИСТЕМА КАК ФАКТОР РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ К ЦИТОТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ МОНООКСИДА АЗОТА
© 2015 г. А.Ф. Ванин, Л.А. Островская*, Д.Б. Корман*, В.Д. Микоян, Л.Н. Кубрина, P.P. Бородулин, М .М. Фомина*, Н.В. Блюхтерова*, В.А. Рыкова*
Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4;
*Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН,119334Москва, ул. Косыгина, 4 E-mail: уатп@ро1утег.скрк.га$.гы; larros@list.ru Поступила в p едакцию 18.11.14 г.
Обнаружено торможение роста перевиваемой солидной опухоли у мышей линии BDF1 (карциномы Льюис) при внутрибрюшинном ежедневном введении животным на 1-5-е и 7-11-е сутки после перевивки опухоли водного раствора биядерной формы динитрозильных комплексов железа с глутатионом в дозе 200 мкмолей на 1 кг (в пересчете на одну Fe(NO)2-гpуппу в составе комплексов). П ри соотношениях динитрозильных комплексов железа и свободного глутатиона в растворе, равных 1:1 и 1:10, торможение роста опухоли в ходе введения комплексов (11 суток) составляло соответственно 70 и 85%. После прекращения введения динитрозильных комплексов железа начинался усиленный рост опухоли, более быстрый, чем в контроле. Методом ЭПР обнаружено избирательное накопление динитрозильных комплексов железа в опухоли, а также накопление в ней нитрозильных комплексов гемопротеинов. Последние обнаруживались в опухоли и у контрольных животных. Предполагается, что задержка развития опухоли в ходе введения мышам биядерной формы динитрозильных комплексов железа обусловлена инактивацией под действием NO, высвобождающегося из этих комплексов, гемсодержащих белков, обеспечивающих антинитрозативную защиту, вырабатываемую в злокачественных опухолях.
Ключевые слова: динитрозильные комплексы железа, карцинома легких Льюис, монооксид азота.
Ранее на модели экспериментального эндо-метриоза крыс нами было обнаружено инги-бирование роста доброкачественных эндомет-риоидных опухолей (ЭМО) под влиянием динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) с глутатионом (вБ), представленных моноядерной (М-ДНКЖ)-(08)2Ре^0)2 и биядерной (Б -ДНКЖ)-(08)2Ре2^0)4 формами [1-5].
Введение ДНКЖ с глутатионом (ДНКЖ-вБ) в разовой дозе 12,5 мкмоль/кг (в пересчете на одну Ре^О^-группу) внутрибр юшинно (в/б), ежедневно, десятикратно, начиная со вторых-третьих суток после операции (пересадка 2-миллиметровых фрагментов эпителия матки на внутреннюю поверхность брюшины), приводило к полному ингибированию развития ЭМО у большинства животных. Размеры опухолей, развившихся у контрольных животных за период наблюдения (1 месяц), достигали 1 см в диаметр е. П рименение ДНКЖ по указанной
Сокращения: ЭМО - эндометриоидные опухоли, М- и Б-ДНКЖ - моно- и биядерные динитрозильные комплексы железа, GS - глутатион.
схеме животным с развившимися опухолями (1 см) приводило к исчезновению из ЭМО эндо-метриальных цист, обеспечивающих пролиферацию этих опухолей, т.е. и на стадии уже развившегося эндометриоза ДНКЖ способны подавлять этот процесс.
Было предположено, что цитотоксическое действие ДНКЖ на эндометр иоидные опухоли было обусловлено р азрушительным действием на эти комплексы хелато ров железа, продуцируемых данными быстропролиферирующими опухолями, для их обеспечения железом. Забирая на себя железо из ДНКЖ, эндогенные хе-латоры тем самым обеспечивали появление вблизи или внутри ЭМО значительного количества N0, высвобождающегося из ДНКЖ с последующим его окислением в цитотоксиче-ский пероксинитрит. Это предположение было сделано исходя из результатов исследования влияния ДНКЖ с различными тиолсодержащи-ми лигандами на пролиферацию клеток ЫеЬа, в которых было показано, что динитрозильные комплексы могли оказывать цитотоксическое действие на клетки пр и быстром распаде
ДНКЖ под действием pазличных экзогенных хелаторов железа [6]. Этот распад приводил к высвобождению из комплексов значительного количества NO. Последующая реакция NO с анионами супероксида приводила к образованию большого количества высокотоксичного пероксинитрита, что и вызывало гибель клеток HeLa по механизму апоптоза.
В связи с вышесказанным представлялось интересным проверить, могут ли ДНКЖ с ти-олсодержащими лигандами оказывать цитоток-сическое действие и на быстропролиферирую-щие злокачественные опухоли по механизму, предполагаемому для аналогичного действия указанных комплексов на ЭМО. Такого рода исследования, проведенные нами на модели перевиваемой солидной опухоли мышей - карциноме легких Льюис, показали, что ежедневное внутрибрюшинное введение этим животным (мыши линии BDF1) ДНКЖ-GS в дозе 2550 мкмоль/кг в течение 10 суток, начиная со следующих суток после перевивки опухоли, приводит к торможению роста подкожной опухоли, развивающейся у мышей. Через неделю после перевивки опухоли на фоне продолжающегося введения животным ДНКЖ начинался усиленный рост этой опухоли [7].
В настоящей работе пр иводятся результаты дальнейших исследований влияния на развитие карциномы Льюис ДНКЖ-GS при тех же условиях эксперимента, но при более высокой дозе этих комплексов (200 мкмоль/кг в пересчете на одну Fe(NO)2-гpуппу в комплексе).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. При синтезе препаратов Б -ДНКЖ с глутатионом использовали сернокислое железо (FeSO47H2O) (Fluka, Швейцария), восстановленный глутатион и нитрит натрия (Sigma, США).
Синтез Б-ДНКЖ c глутатионом. Синтез пр е-пар ата ДНКЖ с глутатионом, в котор ом пр е-обладала биядерная форма этих комплексов (Б-ДНКЖ), проводили по методике, описанной в [8]. В соответствии с этой методикой, синтез этих комплексов лимитровался уровнем нитрита, точнее уровнем S-нитрозоглутатиона (GS-NO), образующегося из нитрита и глутатиона в кислой среде. Последующее превращение GS-NO в ДНКЖ-GS осуществляли повышением рН ра створ а GS-NO в присутствии 10-кратного избытка двухвалентного железа. После выдерживания этого раствор а при 4°С в течение ночи, приводившего к полному превращению GS-NO в ДНКЖ-GS, железо, не включившееся в эти комплексы и выпавшее из раствора в
форме гидроокисных комплексов, удаляли фильтр ацией раствора на бумаге. П ри молярном соотношении исходных препаратов железа (Ре804-7И20), ^N02 и глутатиона, равным 1:1:2 и рН ра створ а 7,4, полученный пр епа рат ДНКЖ-вБ был представлен в основном в форме Б-ДНКЖ. К роме него в раствор е со хр анялся свободный глутатион в молярном соотношении к Б-ДНКЖ, равном 1:1. В ряде опытов использовали препарат Б-ДНКЖ, к котор ому после удаления от него гидроокисного железа добавляли глутатион (с поддержанием рН раствора при 7,4), так что молярное соотношение глутатион Б-ДНКЖ повышалось до 10:1.
Концентрацию синтезированного Б-ДНКЖ с глутатионом оценивали оптическим методом по интенсивности характерных для этого комплекса полос поглощения на 310 и 360 нм с коэффициентами экстинкции, равными соответственно 9200 и 7400 М-1см-1 [9]. При концентрациях исходных р еагентов (Ре804-7И20), NaN02 и глутатиона, равных соответственно 40, 40 и 80 мМ, выход Б-ДНКЖ с глутатионом составлял 10 или 20 мМ (в пересчете на одну Ре^0)2-группу в Б-ДНКЖ).
Биологический эксперимент. Эксперименты проведены на 60 мышах линии ББР^ самках с массой тела 18-20 г разведения питомника РАМН «Столбовая». В качестве опухолевой тест-системы служила солидная опухоль мышей - карцинома легких Льюис, перевиваемая подкожно в соответствии со стандартной методикой [10].
Водный раствор Б-ДНКЖ с глутатионом вводили мышам внутрибрюшинно десятикратно (на 1-5-е и 7-11-е сутки после перевивки опухоли) в дозе 200 мкмоль/кг (в пересчете на одну Бе^0)2-гр уппу) Б -ДНКЖ. В опытах использовали два р а створа Б-ДНКЖ, содержавших свободный глутатион в моляр ном соотношении с Б-ДНКЖ, равном 1:1 и 10:1. Контрольная группа животных и каждая группа животных, получавших это терапевтическое воздействие, состояла из 20 животных. Половину всех животных забивали на 11-й день после перевивки опухоли. Наблюдение за второй половиной животных продолжали в течение всего периода развития опухоли, вплоть до гибели животных.
ЭПР-измерения образцов тканей животных.
Для оценки уровня ДНКЖ, накопившегося в тканях мышей в результате введения им Б -ДНКЖ-вБ за час перед последней (десятой) инъекцией комплексов, половина животных была забита с последующим извлечением опухо-лей, печени, легких, селезенки, мозга и крови,
Время после перевивки опухоли, сут
Рис. 1. Кинетика изменения массы опухоли при р азвитии кар циномы Льюис в контр оле (кр ивая 1) и пр и воздействии пр епар атов ДНКЖ -в 8-1 (кр и-вая 2) и ДНКЖ-08-10 (кривая 3) в разовой дозе 200 мкмоль/кг, внутрибрюшинно, с 1-х по 11-е сутки.
котор ые помещали в соответствующие цилиндр ические ампулы диаметр ом 4 мм с последующим замо р аживанием в жидком азоте. Аналогичную пр оцедуру пр оводили с контр ольными животными (без введения им Б-ДНКЖ -08). Вес извлеченных из этих ампул замо р оженных обр азцов тканей цилиндр ической фо р мы со став-лял не менее 0,5 г при длине образца не менее 3 см. Пр и такой длине обр азец полностью заполнял рабочий объем резонато р а радиоспек-т р ометр а.
Для получения обр азцов опухолей, селезен -ки и легких массой 0,5 г смешивали опухоли, взятые от трех мышей, легких и селезенки -от двух животных. Измерения спектров ЭПР пр оводили на модифицир ованном р адиоспек-тр ометр е фир мы «Р адиопан» (Польша) пр и темпер атур е жидкого азота (77 К).
Концентрацию парамагнитных центров в обр азцах опухолей и печени (М-ДНКЖ и нит-розильных комплексов гемопротеинов) проводили методом двойного интегрирования с использованием в качестве эталонного образца р аствор а М-ДНКЖ с глутатионом, полученного путем повышения р Н 10 мМ р а створ а Б -ДНКЖ с глутатионом от нейтр альных значений до рН 11. Это подщелачивание приводило к полной трансформации диамагнитного Б -ДНКЖ (10 мМ) в пар амагнитный М-ДНКЖ с глутатионом (20 мМ), хар актер изующийся сигналом ЭП Р со следующими значениями #-фак-тор а: ^ = 2,04, ^ = 2,013, ^р = 2,03 [9].
Статистическая обработка данных. Статистическая обработка оценок мас
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.