научная статья по теме АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИСТЬЕВ MELILOTUS ALBUS И TRIFOLIUM MEDIUM ИЗ ТЕХНОГЕННО НАРУШЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЙ СРЕДНЕГО УРАЛА ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕДИ Биология

Текст научной статьи на тему «АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИСТЬЕВ MELILOTUS ALBUS И TRIFOLIUM MEDIUM ИЗ ТЕХНОГЕННО НАРУШЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЙ СРЕДНЕГО УРАЛА ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕДИ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 3, с. 369-375

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИСТЬЕВ Melilotus albus И Trifolium medium ИЗ ТЕХНОГЕННО НАРУШЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЙ СРЕДНЕГО УРАЛА ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕДИ © 2012 г. Э. Р. Фазлиева*, И. С. Киселева*, Т. В. Жуйкова**

*Уральский государственный университет им. А.М. Горького, Екатеринбург **Нижнетагильская государственная социально-педагогическая академия, Нижний Тагил

Поступила в редакцию 01.04.2011 г.

Изучали физиологические механизмы адаптации двух широко распространенных видов бобовых растений: донника белого (Melilotus albus M.) и клевера среднего (Trifolium medium L.), произраставших в местах с разным уровнем техногенной нагрузки, к медь-идуцированному стрессу. В ответ на действие 10 мМ CuSO4, который является стрессорным фактором для растений, активировалась защитная антиоксидантная система. У исследованных видов обнаружили специфические биохимические особенности, обусловленные адаптацией к загрязнению почвы медью. У обоих видов из разных местообитаний обнаружена активация супероксиддисмутазы в условиях медь-инду-цированного стресса. Растения M. albus из импактной зоны обладали лучшей способностью накапливать пролин в сравнении с растениями из фоновых местообитаний, а растения T. medium имели более активную пероксидазу. Предположили, что растения, находящиеся в условиях сильного продолжительного стресса, по сравнению с теми, которые не испытывают или в меньшей степени испытывают стресс, обладают большей устойчивостью к ионам меди.

Ключевые слова: Melilotus albus — Trifolium medium — тяжелые металлы — медь — пролин — супероксид-дисмутаза — пероксидаза — перекисное окисление липидов

ВВЕДЕНИЕ

Антропогенное воздействие является мощным экологическим фактором, влияющим на растительный мир. По силе и разнообразию действия оно часто превосходит естественные факторы. К экстремальным антропогенным факторам, способным вызвать повреждения растительных организмов, следует отнести загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами.

Известно, что тяжелые металлы вызывают образование активных форм кислорода (АФК) и окислительный стресс в клетках, денатурацию белков, повреждение нуклеиновых кислот, перекисное окисление липидов (ПОЛ). Повышенный уровень липопероксидации наблюдается как при кратковременном, так и при хроническом действии тяжелых металлов. В настоящее время существуют данные, свидетельствующие, что увеличение интенсивности ПОЛ при стрессе является не только следствием нарушения гомеостаза, но и представляет собой компонент адаптационного процесса [1, 2].

Сокращение: СОД — супероксиддисмутаза. Адрес для корреспонденции: Киселева Ирина Сергеевна. 620083 Екатеринбург, пр. Ленина, 51. Уральский государственный университет им. А.М. Горького. Электронная почта: Irina.Kiselyova@usu.ru

Важную роль в защите от негативного воздействия свободных радикалов и в адаптации растений к действию техногенных загрязнителей играют ферменты антиоксидантной защиты и низкомолекулярные антиоксиданты. В качестве универсального стресс-протекторного соединения у высших растений выступает пролин, обладающий полифункциональным биологическим эффектом, в том числе, вероятно, и антиокси-дантным [3]. Ключевым ферментом, защищающим клетку от АФК, служит супероксиддисмутаза (СОД), превращающая супероксид-анион-радикал в пероксид. Согласно имеющимся данным [4-6], многие воздействия, приводящие к увеличению в клетке концентрации АФК, вызывают активацию СОД. От образовавшейся в результате восстановления супероксида перекиси водорода клетку защищает фермент пероксидаза, разлагающая пероксид с образованием молекулярного кислорода и воды.

Медь является одним из главных поллютантов на антропогенно измененных территориях Среднего Урала. В низких концентрациях медь — незаменимый для растений микроэлемент. Однако избыточные дозы меди токсичны, они активизируют процессы свободнорадикального окисления, вследствие чего нарушаются структура биологических мембран и физиолого-биохимиче-

ские процессы. Можно предположить, что растения, встречающиеся на загрязненных территориях, обладают биохимическими особенностями, обеспечивающими их устойчивость к техногенным факторам, в частности, тяжелым металлам. Известна устойчивость бобовых к повышенным концентрациям тяжелых металлов в почвах, обусловленная, предположительно, высоким содержанием в их клетках специфических белков и других защитных веществ, позволяющих в значительной степени нейтрализовать токсическое действие тяжелых металлов [7; 8; 9, с. 200293]. Это определило наш выбор объектов настоящего исследования.

Целью работы было изучение роли отдельных компонентов антиоксидантной защитной системы в адаптации дикорастущих видов растений к избытку меди в окружающей среде.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования были травянистые многолетники (сем. Fabaceae): донник белый (Melilotus albus M.) и клевер средний (Trifolium médium L.) [10], эврибионтные виды, встречающиеся в градиенте загрязнения.

Растения донника белого были взяты из пяти местообитаний в окрестностях г. Нижний Тагил Свердловской обл., в разной степени подверженных техногенному воздействию. Это с. Покров-ское, Корабельный мыс, п. Рудник им. III Интернационала, Алапаевская ветка и Строгановский отвал. Клевер средний произрастал только в трех местообитаниях: с. Покровское, Корабельный мыс и Алапаевская ветка.

Суммарная токсическая нагрузка (^¡) на исследованных участках, оцененная по содержанию в почве тяжелых металлов, изменялась от 1.00 до 22.78 отн. ед. [11]. Для расчета S¡ в почве были определены концентрации Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb методом пламенной атомно-абсорбци-онной спектрометрии на спектрофотометре AAS 300 ("Perkin Elmer"). Тем же методом измеряли концентрацию меди в листьях растений, обитающих в природных биотопах, предварительно проводя их озоление с последующей экстракцией 20% HNO3 в течение 7 дней.

Физиологическую устойчивость растений к присутствию в среде меди оценивали по уровню ПОЛ, изменению содержания низкомолекулярного антиоксиданта пролина и ферментативной активности СОД и гваяколовой пероксидазы в норме и при стрессе. В качестве стрессового фактора был выбран сульфат меди в концентрации 10 мМ.

Для получения растительного материала брали по 10 особей M. albus и T. médium в период массового цветения из каждого исследованного биотопа. Пробы листьев отбирали из средней части по-

бегов растений, находящихся в средневозрастном онтогенетическом состоянии. С каждого растения брали один типичный лист, из которого пробочным сверлом высекали 6 дисков. Для проведения эксперимента все листовые высечки сначала выдерживали на свету в дистиллированной воде в течение 2 ч для насыщения водой и предотвращения развития водного стресса. Затем половину материала (3 листовые высечки) продолжали выдерживать в дистиллированной воде (контрольный вариант), другую переносили в раствор CuSO4 на 2 ч (опытный вариант). Таким образом, для каждого из исследованных видов эксперимент был проведен в 10 биологических повторно-стях (10 растений). Число аналитических повтор-ностей при определении изученных параметров — 6. Температуру воды или раствора сульфата меди поддерживали на уровне 23° ± 1°С. В контрольных и опытных растениях определяли концентрацию пролина, активность супероксиддисмутазы (СОД) и пероксидазы, интенсивность ПОЛ.

Содержание свободного пролина в растениях определяли по методу Bates [12] в модификации Калинкиной с соавт. [13] с использованием кислого нингидринового реактива. Для этого навеску листьев (200 мг) помещали в пробирку, заливали 10 мл кипящей дистиллированной воды и помещали на 10 мин в кипящую водяную баню. В пробирки вносили 1 мл приготовленного экстракта, 1 мл ледяной уксусной кислоты, 1 мл нингидри-нового реактива и помещали в кипящую водяную баню на 1 ч, затем охлаждали во льду. Интенсивность окраски определяли спектрофотометриче-ски при длине волны 520 нм. Концентрацию свободного пролина определяли по калибровочной кривой.

Интенсивность ПОЛ определяли по накоплению малонового диальдегида (МДА) с использованием реакционной среды, содержавшей 0.25% тиобарбитуровую кислоту (ТБК) в 10% ТХУ [14]. Растительный материал (300 мг сырых листьев) растирали в ступке в 1 мл реакционной среды, го-могенат помещали в кипящую водяную баню на 30 мин. Затем пробы резко охлаждали в холодной воде (10°С). Содержимое проб центрифугировали в течение 10 мин при 10000 g. Определяли оптическую плотность (ОП) растворов при длине волны 532 и 600 нм против реакционной среды. Концентрацию МДА рассчитывали по формуле:

МДА (ммоль/г сырого веса) = = (ОП532 - ОП60с)/(155 х 0.3),

где 155— коэффициент экстинкции ТБК (мМ-1 см-1); 0.3 — навеска растительного материала (г).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли методом, основанным на измерении ингибирования фотохимического восстановления нитросинего тетразолия [15]. Растительный

Содержание меди в почве на исследованных участках и в произрастающих на них растениях

Местообитание Зона Si, отн. ед. по [11] Содержание меди в почве, мкг/г сухой массы Содержание меди в надземных органах, мкг/г сухой массы (по данным [11]) М ± т

с. Покровское фоновая 1.00 12.26 ± 1.80 6.18 ± 0.46

Корабельный мыс буферная 3.33 38.62 ± 0.59 9.72 ± 1.50

п. Рудник им. III Интернационала буферная 6.19 101.57 ± 11.13 9.68 ± 1.28

Алапаевская ветка буферная 8.36 78.64 ± 12.41 6.17 ± 0.56

Строгановский отвал импактная 22.78 951.49 ± 236.00 42.89 ± 10.50

материал растирали на льду в 0.1 М фосфатном буфере, pH 7.8, с добавлением кварцевого песка. Гомогенат центрифугировали (15000 g, 20 мин), в супернатанте определяли активность СОД. Реакционная среда, приготовленная на 0.1 М фосфатном буфере, содержала 12 мМ L-метионин, 0.075 мМ нитросиний тетразолий. Реакцию запускали добавлением 0.12 мМ рибофлавина. "Световой контроль" и опытную пробу помещали на 20 мин на свет, а "темновой контроль" — в темноту. Реакцию проводили в термостатированных условиях (30°С) и останавливали, помещая пробирки с опытной пробой и "световым контролем" в темно

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком