ш
УДК 577.112.6.017
АНТИОКСИДАНТНАЯ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АНАЛОГОВ ПЕПТИДА ДЕЛЬТА-СНА
© 2014 г. И. И. Михалева*, #, В. Т. Иванов*, Л. В. Оноприенко*, И. А. Прудченко*, Л. Д. Чикин*, Р. И. Якубовская**, Е. Р. Немцова**, О. А. Безбородова**
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
**ФГБУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, Москва Поступила в редакцию 23.04.2013 г. Принята к печати 19.08.2013 г.
С целью изучения потенциальных возможностей применения аналогов пептида дельта-сна (DSIP) в онкологии синтезированы 16 пептидов, отличающихся по структуре от DSIP заменами 1—2 а.о. Исследованы антиоксидантные свойства пептидов in vitro и их детоксицирующая активность in vivo в модели токсикоза, вызванного цитостатиком цисплатином, широко применяемым в терапии опухолевых заболеваний. Показано, что практически все исследованные аналоги DSIP проявляют прямую антиоксидантную активность, причем аналог ID-6 обладал активностью более высокой, чем DSIP, и сравнимой с таковой для витамина С и Р-каротина. Данный аналог продемонстрировал также наиболее выраженный среди исследуемых пептидов детоксицирующий эффект по отношению к действию цисплатина, что проявлялось как в снижении до 17% гибели животных от острой токсичности, по сравнению с 50—67% в контроле, так и в улучшении ряда биохимических показателей крови — снижении активности ферментов аспартат- и аланинаминотрансфераз и концентрации конечных продуктов азотистого обмена: креатинина и мочевины. Таким образом, пептиды семейства DSIP могут оказаться перспективными средствами для снижения токсических эффектов цитоста-тиков, применяемых в онкологии.
Ключевые слова: пептид дельта-сна (ББ1Р), аналоги, антиоксидантная активность, детоксицирую-щее действие, пептиды, синтез, перекисное окисление липидов, цисплатин.
DOI: 10.7868/S0132342314010084
ВВЕДЕНИЕ
Пептид дельта-сна, Тгр-А1а-01у-01у-А8р-А1а-8ег-01у-01и (Э81Р), является эндогенным регу-ляторным пептидом, обладающим полифункциональным пролонгированным действием на организм [1, 2]. Результаты изучения Э81Р и его аналогов на протяжении уже 30-летнего периода со времени его открытия позволяют с уверенностью утверждать, что пептид дельта-сна — уникальный представитель семейства пептидных нейромодуля-торов. Он проявляет выраженное стресс-протек-
Сокращения: А1Т — аланинаминотрансфераза; Д8Т — аспартатаминотрансфераза; В1БА — диизопропилэтил-амин, В81Р — дельта-сон-индуцирующий пептид; сНех — циклогексил; Бтсс — флуоренилметилоксикар-бонил; ОАВА — у-аминомасляная кислота; НВТи — 2-(1-гидроксибензотриазолил)-1,1,3,3,-тетраметилуро-ниумгексафторфосфат, МВА — малоновый диальдегид; ТБА — трифторуксусная кислота; АОА — антиоксидантная активность; ПОЛ — перекисное окисление липидов.
# Автор для связи (тел.: +7 (495) 335-53-66; эл. почта: imikha@ibch.ru).
тивное действие, уменьшает стресс-индуциро-ванные метаболические и функциональные нарушения в организме человека и животных при стрессовых воздействиях самой различной природы. Эффекты пептида реализуются посредством модулирующего воздействия на центральные регуляторные процессы, благодаря системному антиоксидантному действию, модулирующему влиянию на активность ОАВА-ер-гических, глутаматергических и других нейро-нальных систем, влиянию на экспрессию генов раннего ответа в структурах мозга, на активность биосинтетических и протеолитических процессов [3—6]. Изучение пептида дельта-сна продолжается и в настоящее время, поскольку еще осталось много невыясненного в отношении механизма и спектра его биологического действия.
Ранее уже были выполнены отдельные исследования онкопротективных свойств Э81Р и группы его аналогов и установлено, что 10-членный циклический аналог Э8!Р повышал противоопу-
1 2
3 4 5 6 7 8 9
Аналоги В81Р. Жирным шрифтом выделены замененные аминокислотные остатки в сравнении с В81Р. Синтез соединений ГО-10, ГО-16, ГО-18, ГО-19 и ГО-37 был ранее описан по другим методическим схемам в работах [11, 12].
холевую устойчивость животных в условиях инокуляции лейкозных опухолевых клеток L-1210 на фоне стрессового воздействия [7]. Пептид и его циклический аналог значительно ограничивали или отменяли (аналог) вызванное стрессовым воздействием падение активности нормальных киллеров против опухолевых клеток-мишеней, восстанавливая эффективность естественного звена противоопухолевой защиты [8]. Позднее в работе [9] было продемонстрировано, что Э81Р (60 мкг/кг; внутривенно) существенно тормозил метастазиро-вание карциномы Льюис у мышей в условиях чрезмерного стресса — сочетания хирургического удаления опухоли с эмоционально-болевым стрессом. Было установлено снижение количества и объема метастазов с уменьшением индекса стимуляции ме-тастазирования более чем в 4 раза.
В исследованиях на мышах с метастазирующей карциномой Льюиса [10, 11] показано, что Э81Р и некоторые его аналоги существенно уменьшали объем и число метастазов, тормозили инвазию опухолевых клеток, снижали адгезивность клеточного монослоя и активировали угнетенные при опухоле-
вом росте естественные механизмы антиметастатической защиты.
Результаты исследований свидетельствуют о перспективности поиска более активных аналогов пептида дельта-сна с целью создания на их основе лекарственных препаратов для применения в онкологической практике (например, для торможения метастазирования, снижения токсического действия цитостатиков и ограничения нарушений нейроэндокринного статуса.
С целью изыскания новых фармакологически активных производных, перспективных для применения в терапии опухолевых заболеваний, нами были синтезированы Э81Р и группа его аналогов (рисунок) и совместно с сотрудниками МНИОИ им. П.А. Герцена изучены их антиоксидантные и детоксицирующие свойства.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Среди синтезированных нами аналогов (см. ниже) имеются как новые пептиды, так и несколько пептидов, которые мы уже синтезирова-
АНТИОКСИДАНТНАЯ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ 5
Таблица 1. Протокол твердофазного синтеза аналогов DSIP по Fmoc-схеме
Номер шага Растворитель/реагент Объем/количество Число промывок Время, мин
1 20% 4-метилпиперидин в DMF 10 мл 1 1
10 мл 1 20
2 DMF 10 мл 5 1
3 Защищеннная аминокислота HBTU DIEA 2 экв. в 4 мл DMF 2 экв. в 4 мл DMF 4 экв. в 4 мл DMF
4 Перемешивание в течение 120 мин, 20—25°C
5 DMF 10 мл 3 1
ли ранее с использованием других методических схем [11—13]. Группа исследуемых в данной работе аналогов имеет замены в положениях 2, 3, 4, 5 и 7, включает соединения с остатками ^-аминокислот (Ala, Val или BAla) в положении 2 (ID-10, ID-42, ID-38, ID-44), производное с присоединенным ^-концевым дипептидным звеном Gly-Pro (ID-37) и ^-ацетилированное производное DSIP, полученные для увеличения устойчивости пепти-
1
да к аминопептидазам (ID-25) . Два аналога DSIP укорочены с С-конца (ID-10 и ID-18) до 6 остатков в цепи. Синтезирован также выявленный ранее нами [11] гомологичный DSIP 9-член-ный пептид (ID-16), являющийся фрагментом последовательности 14—22 предшественника иммуноглобулина человека (каппа-цепь, V-3-регион), содержащий остатки Trp1, Gly4, Asp5, Gly8 и Glu9, аналогично DSIP (рисунок).
Все пептиды были получены твердофазным методом на автоматическом пептидном синтезаторе с использованием 2-хлортритилхлоридной смолы и Fmoc-производных аминокислот по протоколу синтеза, представленному в табл. 1. Для блокирования боковых функций трифункциональных аминокислот использовали следующие защитные группы: Boc для Lys, OBu' для Asp и Glu, Trt для His и Asn, Bu' для Ser, Thr и Tyr. Для защиты ^-концевой аминогруппы Trp, Tyr или Gly использовали Boc-группу. Наращивание полипептидной цепи на полимерном носителе осуществляли с применением конденсирующего агента HBTU. Реагенты использовали в 2-кратном избытке относительно содержания ре-акционноспособных групп на смоле. Отщепление пептидов от полимера с одновременным деблокированием проводили в 98%-водной TFA.
После деблокирования и отщепления со смолы полученные пептиды растворяли в 0.05% TFA и
1 Шифр "ID" и сквозная нумерация пептидов используется
нами в этой и в других наших работах, где обсуждаются свой-
ства полученных аналогов DSIP (см., например, [11, 12]).
очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте концентрации ацето-нитрила. Процесс препаративной ВЭЖХ контролировали аналитической ВЭЖХ. Пептиды охарактеризованы данными аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии, характеристики приведены в табл. 2.
Антиоксидантную активность DSIP и его аналогов оценивали по их способности ингибировать перекисное окисление липидов (ПОЛ) в гомоге-нате печени мышей in vitro (табл. 3), используя в качестве образцов сравнения витамин С и Р-ка-ротин.
Следует отметить, что в применяемом тесте оценивалось только прямое антиоксидантное действие соединений, т.е. их способность выступать в качестве мишеней для свободнорадикальных продуктов. Проведенные ранее эксперименты не выявили существенного прямого антиоксидантного действия у DSIP и некоторых его аналогов. Для соединений этой группы характерна весьма значительная непрямая АОА, опосредованная воздействием на активность ряда антиоксидантных ферментов [14, 15]. Однако оценка прямой АОА представляла интерес в связи с тем, что ее наличие может свидетельствовать о возможной детоксици-рующей активности пептидов, поскольку имеются свидетельства о защитном действии прямых анти-оксидантов в условиях терапевтического применения некоторых цитостатиков [16]. Как видно из данных, представленных в табл. 3, все исследованные пептиды обладают АОА. Удельную АОА, рассчитывали как обратную величину от молярной концентрации исследуемого образца, необходимой для 50% ингибирования ПОЛ, и выражали в условных единицах (усл. ед.). Найденные значения АОА пептидов находилась в диапазоне от 0.9 до 2.2 усл. ед. активности, что сравнимо с активностью витамина С и Р-каротина. Максимальная АОА (2.2 усл. ед.) активность пептида ID-16 в 1.3 раза превыш
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.