ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 461, № 4, с. 468-471
БИОФИЗИКА, БИОХИМИЯ, ^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 518.19-122.5.04
АНТИПАТОГЕННЫЙ ФЕНОМЕН ЦИКЛОГЕКСИМИДА © 2015 г. А. М. Егорова, академик РАН И. А. Тарчевский
Поступило 18.11.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565215100242
В ходе протеомного анализа влияния салициловой кислоты (СК) на корни гороха мы обнаружили появление ряда белков (СК-маркерные белки), которые отсутствовали в контрольном варианте без обработки СК [1]. Использование радиоактивно меченных аминокислот показало, что для этих белков характерна наиболее высокая радиоактивность [2]. Разнонаправленное изменение удельной радиоактивности у остальных сали-цилатиндуцируемых белков позволило предположительно судить о вкладе протеолиза в изменение их содержания. Мы решили получить дополнительную информацию об этом с помощью цикло-гексимида (ЦГ) — ингибитора трансляции, осуществляемой SOS-рибосомами. Интерес к этому был вызван также отсутствием публикаций о влиянии ЦГ на протеомы растений.
Семена гороха (Pisum sativum L., сорт "Труженик") стерилизовали в течение 20 мин в растворе перманганата калия, после этого промывали дистиллированной водой и проращивали на влажной фильтровальной бумаге в темноте в течение 3 сут. Затем проростки гороха помещали на 5 сут в питательную среду Хогланда—Арнона при 25°C и освещении люминесцентными лампами при 16-часовом световом периоде. Для обработки растений эффекторами 8-суточные проростки погружали корнями в среду, содержащую СК (50 мкМ) или ЦГ (10 мкМ), или СК (50 мкМ) + ЦГ (10 мкМ). Контролем служили проростки, находящиеся в среде Хогланда—Арнона без добавления каких-либо эффекторов.
При выборе концентрации ингибитора (10 мкМ) мы учитывали полученную ранее другими авторами [3—6] информацию о том, что относительно невысокая концентрация ЦГ не вызывала снижения общего содержания растворимых белков, в отличие от более высокой (10 мМ). Концентрация СК, равная 50 мкМ, была определена нами как оптимальная в ходе предыдущих исследований [1, 2].
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук E-mail: tarchevsky@mail.knc.ru
Через 3 сут корни отрезали и фиксировали жидким азотом. Экстракцию растворимых белков корней проводили по методике, использовавшейся в предыдущей работе [2]. 20-электрофорез проводили на приборах Protean IEF Cell, Protean II xi 2-D Cell ("Bio-Rad", США) с использованием стрипов длиной 17 см с иммобилизованным индикатором линейного градиента pH 4—7. Для нанесения на стрипы для изофокусирования белки растворяли в буфере, содержащем 6 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% (w/v) CHAPS (3-[(3-хо-ланидопропил)диметиламмоний]-1-пропанс-ульфонат), 50 мМ ДТТ и 0.5% (v/v) Bio-Lyte ("BioRad"). Пробы для нанесения на стрипы содержали равное количество белка (550 мкг). Разделение белков по молекулярным массам проводили в 12.5%-м ПААГ. Пластины геля окрашивали Ку-масси G-250. Сканирование проводили на сканере EPSON 4990 Photo. Полученные изображения гелей обрабатывали с помощью программы PDQuest ("Bio-Rad"). Пятна интересующих белков были вырезаны вручную и подвергнуты трип-синолизу. Масс-спектры были получены на масс-спектрометре ESI-Q-TOF MicrOTOF-Q ("Bruk-er", Германия) в режиме наноспрея с предварительным разделением полученной смеси пептидов на хроматографе Ultimate 3000 ("Dionex", Нидерланды). Спектры снимали в положительном режиме ионизации, обрабатывали с помощью программы DataAnalisys ("Bruker Daltonics", Германия). Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrix-science.com). Поиск возможных претендентов проводился по базе данных NCBInr с указанием подбазы — зеленые растения. Идентифицированными считали те белки, у которых по крайней мере два пептида имели показатель достоверности поиска выше 49 (p < 0.05).
Используемая нами концентрация ЦГ не вызвала достоверного изменения общего содержания растворимых белков в корнях гороха (рис. 1). Большинство белков на электрофореграмме контрольного варианта (рис. 2) оказались ЦГ-неза-висимыми, как показал анализ с помощью программы PDQuest. В то же время под влиянием ЦГ достоверно понизилось содержание почти 30 бел-
Общее содержание растворимых белков, мг/г сырого веса 14 г
12 -
4 -
2 -
0-1-1
Контроль ЦГ 10 мкМ
Рис. 1. Влияние циклогексимида (10 мкМ) на общее содержание растворимых белков в корнях гороха; М± т, п = 3.
ков, что свидетельствует о свойстве ЦГ как ингибиторе трансляции. Не исключено также, что эти белки являются мишенями достаточно активных и специфичных протеаз.
Подтверждением ингибирующего действия ЦГ на синтез белков явилось устранение им сали-цилатиндуцирующего действия на белки корней. Салициловая кислота вызывала появление (рис. 3) отсутствовавших в контрольном варианте не-идентифицированных нами белков (пятна 1, 2 и 3) и повышение содержания неидентифицированно-го белка в СК-варианте (пятно 4), что было показано нами ранее [1, 2]. Обработка корней ЦГ привела к полному ингибированию синтеза белков 1—3 и к устранению вызванного СК повышения содержания белка 4 (рис. 3). Это подтвердило сделанный на основании опытов с 14С-аминокисло-тами вывод об отсутствии значимого вклада СК-индуцируемого снижения активности протеаз в повышение содержания этих белков [2].
Парадоксальным явилось вызванное ЦГ существенное повышение содержания около 30 бел-
кДа
102.0 72.0
47.8 34.0 26.8
17.0
Рис. 2. Электрофореграмма растворимых белков корней гороха. Контроль. Прямоугольниками обозначено расположение маркерных СК-индуцируемых белков (I и II), стрелками и цифрами — циклогексимидиндуцируемые белки: 5 — кофеоил-КоА-метилтрансфераза, 6 — халконфлавонизомераза, 7 — изофлавонредуктаза.
470
ЕГОРОВА, ТАРЧЕВСКИЙ
ков, в том числе (табл. 1) кофеоил-КоА-метил-трансферазы, халконфлавонизомеразы и изофла-вонредуктазы (рис. 3, соответственно пятна 5, 6 и 7), кодируемых ядерными генами.
В корнях гороха, обработанных совместно СК и ЦГ, мы также наблюдали повышение содержания этих белков по сравнению с вариантом, обработанным лишь одним СК (табл. 1).
Кофеоил-КоА-метилтрансфераза относится к ферментам фенилпропаноидного метаболизма, принимает участие в синтезе лигнина клеточных стенок, что препятствует проникновению в клетки патогенных микроорганизмов. У растений с антисмысловыми транскриптами этого фермента синтез лигнина был подавлен [5].
Изофлавонредуктаза является одним из ключевых ферментов той ветви фенилпропаноидного метаболизма, которая завершается синтезом различных антипатогенных фитоалексинов, например, птерикарпана бобовых растений [6]. К этой же ветви относится халконфлавонизомераза, участвующая в синтезе флавоноидов, изофлавоноидов и фи-тоалексинов [7].
Феномен вызванного ЦГ накопления этих ферментов позволяет прийти к заключению, что клетки растений отвечают на действие ЦГ, как на атаку патогенных микроорганизмов с помощью неизвестного сигнального механизма. Этому не противоречит и обнаруженное у многих растений вызванное ЦГ сильное накопление транскриптов вследствие активации экспрессии многих ядерных генов [8].
Наиболее простой причиной появления фе-нилпропаноидного феномена ЦГ могло быть существование неизвестного акцептора, взаимодействие которого с ЦГ активирует антипатогенную сигнальную цепь, аналогичную классическим салицилатному или жасмонатному сигнальным путям. Этот акцептор должен иметь более высокое сродство к ЦГ, чем 808-рибосомы цито-золя. Так как ЦГ, как известно, продуцируется почвенными фитопатогенными бактериями 81гер1отусв8 griseum, то можно предположить, что у корней растений выработался механизм узнавания этих патогенов при концентрациях ЦГ, даже не вызывающих сильного ингибирования рибо-сомального синтеза белков, но способствующих образованию антипатогенных соединений.
Нельзя исключить возможности специфического ЦГ-обусловленного ингибирования синтеза и активности определенных протеаз, мишенями которых являются белки идентифицированных нами вышеупомянутых ферментов фенилпропаноидно-го антипатогенного метаболизма.
Возможны и другие механизмы ЦГ-обуслов-ленного повышения содержания антипатогенных белков, например, механизм, связанный с повышением содержания аминокислот, вызываемым
К
СК
ЦГ
ЦГ
+
СК
Рис. 3. Влияние циклогексимида на содержание СК-индуцируемых белков. I и II — места их расположения на электрофореграммах; 1—4 — индивидуальные неидентифицированные СК-индуцируемые белки.
низкими концентрациями ЦГ [9, 10]. Возможность аминокислотной сигнальной трансдукции ранее была установлена при исследовании клеток животных, а затем и растительных объектов [11—13]. Повышение содержания сигнальной аминокислоты приводит к ее взаимодействию с расположенным в плазмалемме трансмембранным рецептором, к открыванию содержащейся в нем кальциевой поры и транспорту из апопласта в ци-тозоль ионов кальция. Известно, что сходный эффект ("кальциевый взрыв") вызывает атака патогенных микроорганизмов [14], что приводит к активации кальцийсвязывающих белков и, в конечном итоге, к синтезу защитных белков.
Возможной причиной обнаруженного нами феномена действия ЦГ может быть также неодинаковая чувствительность к ЦГ клеток разных тканей. Известно, что лигнин накапливается, главным образом, в клетках проводящих сосудов корней, и не исключено, что эти клетки более устойчивы к действию ЦГ. Нельзя также исключать изменение ЦГ-чувствительности рибосом вследствие посттрансляционной модификации рибосомальных белков [15]. Последнее может привести к избирательному функционированию рибосом в отношении поступающих из ядра раз-
I II
4 4
1 2 3 4 4
Таблица 1. Идентифицированные циклогексимидиндуцируемые белки
№ белка Номер белка в базе данных NCBI Идентифицированный белок ММ/pI эксп. ММ/pI теор. Достоверность поиска Число совпавших пептидов Совпадение аминокислотной последовательности, % Кратность изменения содержания белка
СК/ Контр. ЦГ/ Контр. СК + ЦГ/ Контр.
5 gi|502152862 Кофеоил-КоА-ме- 29/5.2 21.9/4.97 206 2 23 1.41 2.14 2.27
тилтрансфераза
(Cicer arietinum)
6 gi|729104 Халконфлавонизо- 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.