МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 5, с. 901-906
= ДНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДК 579.252.5
АНТИРЕСТРИКЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЛКА ArdA, КОДИРУЕМОГО ТРАНСМИССИВНОЙ IncIl ПЛАЗМИДОЙ R64
© 2004 г. Г. Б. Завильгельский*, Т. Ä. Летучая, С. М. Расторгуев
Государственный научный центр Российской Федерации "ГосНИИгенетика", Москва, 117545
Поступила в редакцию 14.11.2003 г.
Конъюгативная плазмида R64 (группа несовместимости IncIl) определяет антирестрикционную функцию: в клетках Escherichia coli K12 с плазмидой R64 эффективность EcoKI-рестрикции немо-дифицированной ДНК фага X ослабевает примерно в 5 раз. Клонировали и определили нуклеотид-ную последовательность гена ardA плазмиды R64. Белки семейства Ard являются специфическими ингибиторами ферментов рестрикции-модификации I-го типа. Белок ArdA R64 высокогомологичен белку ArdA ColIb-P9: эти белки отличаются лишь четырьмя из 166 аминокислотных остатков. В отличие от белка ArdA ColIb-P9, который ингибирует как эндонуклеазную, так и метилазную активности фермента EcoKI, ArdA R64 подавляет только эндонуклеазную активность EcoKI. Предполагается, что ArdA R64 ингибирует формирование комплекса немодифицированной ДНК с R-субъ-единицей фермента рестрикции-модификации I-го типа EcoKI (R2M2S), осуществляющей транслокацию и эндонуклеолитическое расщепление ДНК. Белок ArdA ColIb-P9 способен подавлять формирование комплекса ДНК не только с R-, но также и с S-субъединицей, контактирующей с sK-участком ДНК, в состав которого входят модифицируемые адениловые остатки. Связывание ArdA со специфическим участком sK ингибирует одновременно и эндонуклеазную, и метилазную активности; связывание ArdA с неспецифическим участком в R-субъединице подавляет только эндонуклеазную активность EcoKI (R2M2S).
Ключевые слова: системы рестрикции-модификации I-го типа, антирестрикция, конъюгативная плазмида, ген ardA.
ANTIRESTRICTION ACTIVITY OF THE IncIl TRANSMISSIVE PLASMID R64 ArdA PROTEIN, by G. B. Zavilgelsky, T. A. Letutchaja, S. M. Rastorguev (State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms ("GosNIIGenetika"), Moscow, 117545 Russia; e-mail: zavilgel@genetika.ru). The transmissive plasmid IncIl R64 contains the ardA gene encoding the ArdA antirestriction protein. The R64 ardA gene locating in the leading region of plasmid R64 has been cloned and their sequence has been determined. Antirestriction proteins belonging to the Ard family are specific inhibitors of type I restriction-modification enzymes. The IncIl ColIb-P9 and R64 are closely related plasmids, and the latter specifies an ArdA homologue that is predicted to be 97.6% (162 residues from 166) identical at the amino acid sequence level with the ColIb = P9 equivalent. However, the R64 ArdA selectively inhibits the restriction activity of EcoKi enzyme leaving significant levels of modification activity under conditions in which restriction was almost completely prevented. The ColIb-P9 ArdA inhibits restriction endonuclease and methyltransferase activities simultaneously. It is hypothesized that the ArdA protein forms two complexes with the type I restriction-modification enzyme (R2M2S): (1) with a specific region in the S subunit involved in contact with the sK site in DNA; and (2) with nonspecific region in the R subunit involved in DNA translocation and degradation by restriction endonuclease. The association of the ColIb-P9 ArdA with the specific region inhibits restriction endonuclease and methyl-transferase activities simultaneously, whereas the association of the R64 ArdA with a nonspecific region inhibits only restriction endonuclease activity of the R2M2S enzyme.
Системы рестрикции-модификации играют важную роль в жизни бактериальной клетки. В основе явления рестрикции-модификации лежит сопряженное действие рестрикционной эндо-
* Эл. почта: zavilgel@genetika.ru
нуклеазы и ДНК-метилтрансферазы. Ферменты рестрикции-модификации I-, II- и III-го типов "узнают" специфическую последовательность нук-леотидов в ДНК, и рестрикционная эндонуклеаза индуцирует в немодифицированной ДНК двойные разрывы [1, 2]. Для защиты собственной
ДНК от ферментативного расщепления используется специфическое метилирование узнаваемых последовательностей, которое осуществляют ДНК-метилтрансферазы. Эндонуклеазы рестрикции I-, II-, III-го типов эффективно действуют против чужеродной ДНК независимо от способа ее проникновения в клетку: инъекции из фаговой головки, трансформации или конъю-гативного переноса [3-5]. Для систем рестрикции-модификации I-го типа характерны [6]: зависимость эндонуклеазной активности фермента от ATP и SAM (S-аденозилметионин, в случае систем II-го и III-го типов SAM нужен лишь как донор метильной группы при модификации сайта); эндонуклеазная и метилазная активности объединены в единой структуре R2M2S, субъединицы которой (R, M, S) определяют эндонуклеазную, ме-тилазную и узнающую специфический Ж-учас-ток активности соответственно; значительное расстояне (около 2000 п.н.) между sK-участком и индуцированным ферментом двунитевым разрывом ДНК, что обеспечивается транслокацией ДНК через R-субъединицу и сопровождается интенсивным гидролизом ATP.
Способность конъюгативных плазмид и ряда бактериофагов преодолевать действие клеточных эндонуклеаз получила название антирестрикции [7]. Изучение механизмов антирестрикции у конъюгативных плазмид энтеробактерий показало, что в этом процессе участвует специальный белок-антирестриктаза, продукт гена ard (alleviation of restriction of DNA). Впервые гены ard обнаружили в плазмидах N-группы несовместимости (pKM101 и др.) [8, 9], в плазмидах группы несовместимости I (ColIb-P9, R144 и др.) [10, 11], а затем и в ряде других плазмид [12, 13]. Гены ard расположены, как правило, в лидерной области конъюгативных плазмид, примыкающей к участку oriT, началу конъюгативного переноса ДНК, поэтому гены ard одни из первых входят в клетку-реципиент при конъюгации. Бактериофаги T7 и P1 также содержат гены антирестриктаз (ген 0.3 (ocr) у T7 [14, 15] и darA у P1 [16]).
Белки-антирестриктазы семейства Ard (ArdA, ArdB, ArdC, ArdU и др.), а также Ocr (фаг T7) и DarA (фаг P1) эффективно ингибируют ферменты рестрикции-модификации I-го типа. Предполагается [7], что антирестриктазы семейства Ard, а также Ocr (фаг Т7) и DarA (фаг P1) входят в группу белков-модуляторов, структура которых подобна B-форме ДНК с характерным распределением по поверхности молекулы отрицательных зарядов E и D, имитирующих распределение отрицательно заряженных фосфатных групп вдоль двойной спирали ДНК.
Согласно данным рентгеноструктурного анализа третичная структура белка Ocr фага T7, состоящего из 117 аминокислотных остатков, как и
предполагалось нами, подобна B-форме ДНК [17]. B этом случае антирестриктаза должна вытеснять ДНК из комплекса с ферментом рестрикции-модификации за счет структурного подобия с субстратом. И, следовательно, механизм антирестрикции является частным случаем конкурентного ингибирования.
Белок ArdA, ген которого расположен в конъ-югативной плазмиде ColIb-P9, ингибирует одновременно как рестрикционную, так и модифика-ционную активности ферментов рестрикции-модификации I-го типа [11]. B настоящей работе клонировали и секвенировали ген ardA из конъю-гативной плазмиды R64 (IncIl). Показано, что белок ArdA R64 высокогомологичен ArdA ColIb-P9. Эти белки отличаются лишь четырьмя из 166 аминокислотных остатков. Однако в отличие от ArdA ColIb-P9 белок ArdA R64 ингибирует лишь эндонуклеазную активность EcoKI. Предполагается, что ArdA R64 подавляет формирование комплекса немодифицированной ДНК с R-субъеди-ницей фермента рестрикции-модификации I-го типа EcoKI (R2M2S), осуществляющей транслокацию и эндонуклеолитическое расщепление ДНК.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериальные штаммы и бактериофаги.
B работе использовали штаммы Escherichia coli K-12: JM109 recA1 endA1 gyrA96 thi supE44 relA1 hsdR17 A(lac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ AM15] ; JM83 thi ara rpsL A(lac-proAB) I80 lacIqZ AM15; TG1 thi relA supE44 hsdR17 hsdM A(lac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ AM15]; AB1157 F- , thr-1, leu-6,proA2, his-4, thi-1, argE3, lacY1, galK2, ara14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL31, supE44, r+ m+; AB2463 (генотип AB 1157 , также recA13); E. coli Csromo (прототроф). Все штаммы получены из коллекции ГосНИИгенетика.
Бактериофаг ^vir получен от Р. Деворе (Франция). В работе использовали немодифицирован-ные фаги ^.0 и модифицированные фаги ^.K, выращенные на E. coli Cs (или TG1) и E. coli K12 AB1157 соответственно.
Среды. Состав сред и концентрации добавок приведены в работе [10]. В опытах с клонированием использовали L-бульон и L-агар.
Конструирование плазмид. В работе использовали векторы серии pUC. Мультикопийные плазмиды выделяли щелочным методом [18]. В качестве источников генов ardA использовали конъюга-тивную плазмиду R64 (из музея ГосНИИгенетики) и плазмиду pVK6 со встроенным в нее геном ardA ColIb-P9 [10]. Эндонуклеолитическое расщепление, лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили согласно [18]. Реакции расщепления и лигирования проводили с
использованием ферментов фирмы "Fermentas" (Литва). Трансформацию клеток E. coli проводили кальциевым методом [18]. Последовательность нуклеотидов определяли по методу Сэнге-ра [19]. С помощью универсальных прямого и обратного праймеров определяли нуклеотидную последовательность клонированных фрагментов. Гены ardA R64 и ColIb-P9 клонировали с использованием олигонуклеотидных праймеров Nfor и Nrev с последующим накоплением продуктов с помощью ПЦР:
BamHI
Nfor 5'-ctgggatccgggaatgtctgttgttgc-3' PstI
NreV 5'-cattсtgcagcgggggagtaaatcaccg-3'.
Измерение антирестрикционной и антимоди-фикационной активностей белка ArdA. Антирес-трикционную активность (Ard) белка ArdA измеряли с использованием штамма E. coli K-12 AB1157 или AB2463 с активной системой рестрикции-модификации I-го типа EcoKI. Антимодификацион-ную активность (Amd) белка ArdA измеряли с использованием штамма E. coli K12 JM109 rm+ с активной EcoKI-метилаз
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.