ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 9, с. 1033-1039
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 577.21
АНТИРЕСТРИКЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ РТУТНОГО НЕКОНЪЮГАТИВНОГО ТРАНСПОЗОНА Tn505J КОНТРОЛИРУЕТСЯ ПРОТЕАЗОЙ ClpXP © 2014 г. Г. Б. Завильгельский, В. Ю. Котова, О. Е. Мелькина, К. С. Пустовойт
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 117545 e-mail: zavilgel@genetika.ru Поступила в редакцию 03.02.2014 г.
Ртутный транспозон Tn5053 при введении в штаммы Escherichia coli K12 проявляет высокую анти-рестрикционную активность против системы рестрикции—модификации типа I EcoKI. Вклад в ан-тирестрикционную активность Tn5053 вносят продукты генов merR и ardD. Ген merR кодирует белок MerR — регулятор транскрипции генов mer-оперона. Ген ardD, ответственный за синтез белка ArdD, расположен в tni-опероне. В данной работе показано, что антирестрикционная активность транспо-зона Tn5053 отсутствует в штаммах E. coli K12, мутантных по генам clpXи clpP, а также recA. 2-Ами-нопурин не усиливает антирестрикционный эффект Tn5053. В клетках E. coli K12, мутантных по гену dam, антирестрикционная активность Tn5053 не изменяется, но снижается в E. coli K12 mutD. Предполагается, что в результате активности белков MerR и ArdD в бактериальной клетке образуется значительное количество немодифицированной ДНК, что вызывает SOS-зависимый эффект ослабления действия фермента EcoKI (R2M2S) в связи с ClpXP-индуцируемым протеолизом R-субъединицы.
DOI: 10.7868/S0016675814090161
Конъюгативные плазмиды и конъюгативные транспозоны содержат гены аМЛ и атйВ, кодирующие антирестрикционные белки. Белки ЛгёЛ и ЛгёБ специфически ингибируют ферменты рестрикции—модификации типа I [1—6]. Белки семейства ЛгёА одновременно ингибируют ре-стрикционную (эндонуклеазную) и модификаци-онную (метилазную) активности ферментов [3— 5], а белки семейства ЛгёБ ингибируют лишь ре-стрикционную активность ферментов [6, 7]. Значительно различаются эти белки как по первичной, так и по третичной структуре. Белки ЛгёА (165—170 а.о.) несут значительный отрицательный заряд (—25:—30) и относятся к семейству ДНК-мимикрирующих белков, т.е. пространственная структура этих белков подобна биспираль-ной ДНК в В-форме [5]. Белки ЛгёБ (141-153 а.о.) имеют, как правило, небольшой отрицательный заряд (-1:-6), а структурно образуют форму компактного тетраэдера [7]. Наличие генов атйЛ и атйВ помогает мобильным элементам преодолевать рестрикционные барьеры и тем самым обеспечивает эффективный "горизонтальный" перенос генов между бактериями различных видов и родов.
Было показано, что цельный ртутный неконъ-югативный транспозон Тп5053, содержащий два оперона — ртутный оперон тегЯТРЕАОЬ и противоположно направленный оперон транспозиции
tniABQR (рис. 1), введенный в бактериальную клетку Escherichia coli K12 в составе вектора pUC19, снижает рестрикционную активность фермента I типа EcoKI примерно в 100—200 раз [8]. Ранее было показано, что ген merR (кодирует белок — репрессор mer-оперона, определяющего резистентность бактерий к ионам ртути), клонированный под lac-промотором в векторе pUC, при введении в штамм E. coli K12 обнаруживает антирестрикционный эффект против рестрикта-зы EcoKI [9]. Был клонирован [8] новый ген ardD, расположенный внутри гена tniA (кодирует транс-позазу TniA), причем направление транскрипции гена ardD противоположно транскрипции гена tniA и происходит по комплементарной нити ДНК. Ген ardD, в составе вектора pUC19 введенный в E. coli K12, также обнаруживает антире-стрикционную активность против фермента EcoKI. В настоящей работе исследуется влияние проте-азы ClpXP, а также генов recA, recBC, dam, mutD на антирестрикционную активность транспозона Tn5053. Показано, что антирестрикционная активность транспозона Tn5053 отсутствует в штаммах E. coli, мутантных по генам clpX, clpP и recA.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды. Бактериальные штаммы Escherichia coli
Sali
pKLH53.1
pAC- mer
ЗАВИЛЬГЕЛЬСКИИ и др Clai
Hindill
R
Kpnl
Sali
pKLH53.100
Q < B -< ■ А
ardD
7511 7954
mer
tni
Tn5053
тпн 0123456789
Рис. 1. Схематическое изображение структуры транспозона Тп5053 и гибридных плазмид, содержащих различные фрагменты транспозона. рКЕН53.1 — транспозон Тп5053 встроен в вектор риС19; pKLH53.100 — ген merR встроен в вектор риС19; рАС-тег — гены mer-оперона merRTPFADL встроены в вектор pACYC184; pTLORF5 фрагмент ДНК транспозона Тп5053 размером 2.3 тпн, содержащий ген ardD, встроен в вектор риС19.
K12: JM109 recA1 endA1 gyrA96 thi supE44 relA1 hsdR17 A(lac-proAB) [F'traD36proAB lacIqZ AM15]; TG-1 thi relA supE44 hsdR17 hsdM A(lac-proAB) [FtraD36 proABlacIqZAM15]; AB1157 F- thr-1, leu-6, proA2, his-4, thi-1, argE3, lacY1, galK2, ara14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL31, supE44, r+m+; JC7623 recB21 recC22 sbcB15; AB2463 recA13 (остальные маркеры, как у AB1157) (штаммы получены из коллекции ГосНИИгенетика). Штаммы NK113 AclpP::cat и NK114 AclpX::kan, остальные маркеры, как у AB1157, получены от проф. N.E. Murray, Эдинбургский университет, Шотландия.
Штаммы E. coli AB1157 dam::kan и AB1157 mutD::kan сконструированы трансдукцией му-тантных генов dam::kan и mutD::kan из генома JW3350 Adam-722::kan и JW0205 AdnaQ744::kan соответственно с помощью фага P1. Штаммы E. coli K12 JW3350 rmB3 AlacX4787 hsdR5114 AaraBAD567 Adam-722::kan и JW0205 rmB3 AlacX4787 hsdR5114 AaraBAD567 AdnaQ744::kan были получены из "Keio Collection".
Бактериофаг ^vir получен от проф. R. Devoret, Франция. В работе использовали немодифициро-ванные фаги ^.0 и модифицированные фаги ^.K, выращенные на E. coli TG-1 и E. coli K12 AB1157 соответственно.
В работе использовали векторы pUC19 и pACYC184 и гибридные плазмиды pKLH53.1 (pUC19 с клонированным ртутным транспозоном Tn5053) [10], pTLORF5 (pUC19 с клонированным по сайтам KpnI-SalGI 2300-пн фрагментом транспозона Tn5053, содержащим ген ardD) [8], и pKLH53.100 (pUC19 с клонированным по сайтам SalI-#indIII ~500-пн фрагментом транспозона Tn5053, содержащим ген merR) [9]. Гены mer-опе-рона merRTPFADL (фрагмент ДНК Tn5053 разме-
ром около 4 тпн) были встроены по сайтам Clai-Sali в вектор pACYC184; гибридная плазмида обозначена как pAC-mer.
Среды, ферменты, реактивы. LB-среда: 1%-ный триптон, 0.5%-ный дрожжевой экстракт и 0.5% NaCl; для верхнего и нижнего слоев среды в чашках Петри использовали 1.8 и 0.7% LB-агар. Бактерии растили в LB или LB, содержащей антибиотики — 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл канами-цина, 25 мкг/мл хлорамфеникола, при постоянном перемешивании до средней экспоненциальной фазы при 30°C.
Эндонуклеазное расщепление, лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили согласно [11]. Реакции расщепления и лигирования проводили с использованием ферментов фирмы "Fermentas" (Литва). В работе использовали 2-аминопурин фирмы "Aldrich Sigma". Трансформацию клеток E. coli проводили электропорацией.
Измерение антирестрикционной и антимоди-фикационной активностей транспозона Tn5053 и белка ArdD. Для измерения антирестрикционной активности транспозона Tn5053 и белков MerR и ArdD использовали штамм E. coli K12 AB 1157 с активной системой рестрикции—модификации i типа EcoKi. Для измерения антимодификаци-онной активности транспозона Tn5053 использовали штамм E. coli K12 JM109 r-m+ с активной EcoKi-метилазой. Методика измерения антирестрикционной и антимодификационной активностей у белков семейства Ard описана в [12, 13].
Таблица 1. Аддитивность антирестрикционных активностей mer-оперона (гена merR) и гена ardD транспозона Tn5053
Штамм Плазмида Ген Коэффициент рестрикции (K)* фага 1.0 на AB1157 r+m+ Фактор ослабления рестрикции (R)++
AB1157 pUC19 - 1.0 x 10-4 1
» pKLH53.1 merR и ardD 2.0 x 10-2 200
» pKLH53.100 merR 1.0 x 10-3 10
» pAC-mer merR 1.0 x 10-3 10
» pTLORF5 ardD 2.0 x 10-3 20
» pAC-mer, pTLORF5 merR и ardD 2.0 x 10-2 200
* Коэффициент рестрикции (K) определяли отношением титра фага 1.0 на штамме AB1157 к титру этого фага на штамме TG-1 r-m-.
++ Фактор ослабления рестрикции R = K+/K_, где K+ есть K для AB1157 c гибридной плазмидой, а K_ — для AB1157 с вектором pUC19.
Таблица 2. Влияние транспозона Tn5053 на EcoKI-рестрикцию и EcoKI-модификацию в E. coli K12 AB1157 r+m+ и JM109 r-m+*
Плазмида Белок Коэффициент рестрикции (K)** фага 1.0 на AB1157 r+m+ Коэффициент рестрикции (K) фага 1 jmxo9 на AB1157 r+m+
pUC19 - 1.0 x 10-4 1
pKLH53.1 MerR и ArdD 2.0 x 10-2 1
* Фагом 1.0 заражали клетки штамма E. coli JM109 r m+ и после проведения одиночного цикла размножения полученный фаголизат (в таблице обозначен как ^¡тю9) титровали на штаммах TG-1 и AB1157.
** Коэффициент рестрикции (K) определяли отношением титра фага 1.0 (третий столбец) и ^¡м109 (четвертый столбец) на штамме AB1157 к титру этого фага на штамме TG-1 r-m-.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Аддитивный эффект антирестрикционных активностей тег-оперона и гена ardD
Для оценки аддитивности антирестрикционных активностей генов merR, входящего в состав mer-оперона, и ardD, входящего в состав tni-оперо-на, плазмиды pKLH53.100, pAC-mer и pTLORF5 вводили в клетки штамма E. coli AB1157 как по отдельности, так и совместно. В табл. 1 представлены результаты данных экспериментов. Как видим, при трансформации плазмид pKLH53.100, pAC-mer и pTLORF5 в клетки штамма AB1157 по отдельности фиксируется ослабление рестрикции в 10 и 20 раз соответственно. При совместной трансформации этих плазмид в клетки штамма AB1157 ослабление рестрикции достигает 200, что совпадает с таковой для полного транспозона Tn5053 (строки 2 и 6), что указывает на аддитивность действия генов.
Влияние мутаций clpX и clpP на антирестрикционную активность транспозона Tn5053
В работах [14—16] было показано, что протеаза ClpXP расщепляет R-субъединицу фермента ре-
стрикции—модификации типа I (R2M2S1) при контакте фермента с немодифицированной ДНК. В результате в бактериальной клетке имеет место ослабление рестрикции (в связи с уменьшением количества субъединицы — эндонуклеазы R), но модификационная
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.