МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, том 43, № 2, с. 264-273
К ЮБИЛЕЮ ИНСТИТУТА ^^^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ
УДК 579.252.5
АНТИРЕСТРИКЦИОННЫЕ БЕЛКИ ArdA И Oer КАК ЭФФЕКТИВНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ ТИПА I
© 2009 г. Г. Б. Завильгельский*, С. М. Расторгуев
Государственный научный центр "ГосНИИгенетка", Москва, 117545 Поступила в редакцию и принята к печати 08.07.2008 г.
Гены, кодирующие антирестрикционные белки (или антирестриктазы, однако поскольку антирестрик-ционные белки ингибируют активность систем рестрикции-модификации, но сами не проявляют ферментативной активности, термин антирестриктаза можно использовать лишь условно), содержатся в конъюгативных плазмидах (гены ardABC) и геномах бактериофагов (гены ocr, dar A). Антирестриктазы ингибируют ферменты рестрикции-модификации типа I и тем самым защищают немодифицированную ДНК плазмид и бактериофагов от деградации. Антирестрикционные белки относятся к семейству ДНК-мимикрирующих белков (protein mimicry of DNA), пространственная палочкоподобная структура которых имитирует B-форму двуспиральной ДНК. На основе сконструированных с помощью сайт-направленного мутагенеза мутантных форм белков ArdA и Ocr, а также природных белков ArdA, избирательно ингибирующих рестрикционную активность ферментов типа I, но при этом не затрагивающих их метилазную активность, предложена модель формирования комплекса антирестриктазы с ферментом рестрикции-модификации типа I (R2M2S): антирестриктазы способны вытеснять нить ДНК из двух участков, расположенных в S-субъединице (контакт фермента со специфическим сайтом в ДНК) и в R-субъединице (через которую происходит транслокация нити ДНК и ее деградация). Проведен анализ ан-тирестрикционной и антимодификационной активностей белков ArdA и Ocr в зависимости от уровня экспрессии генов ardA и ocr (при клонировании этих генов под строго регулируемым промотором).
Ключевые слова: ферменты рестрикции-модификации типа I, антирестрикция, ArdA, Ocr, конъ-югативные плазмиды, бактериофаги, ДНК-мимикрия.
ANTIRESTRICTION PROTEINS ArdA AND Ocr AS EFFECTIVE INHIBITORS OF THE TYPE I RESTRICTION-MODIFICATION ENZYMES, by G. B. Zavilgelsky*, S. M. Rastorguev (State Research Center "GosNIIgenetika", Moscow, 117545 Russia; *e-mail: zavilgel@genetika.ru). Genes encoding antirestriction proteins (antirestrictases, inasmuch as the antirestriction proteins inhibit the activity of restriction-modification systems, but have no proper enzyme activity, the name antirestrictase is only tentative) are included in the composition of conjugative plasmids (genes ard ABC) and some bacteriophages (genes ocr and dar A). Antirestriction proteins inhibit of the type I restriction-modification enzymes and thus protect unmodified DNA of plasmids and bacteriophages from degradation. Antirestriction proteins belong to the "protein mimicry of DNA" family: the spatial structure is like the B-form of DNA, and therefore the antirestriction proteins operated on the principle of concurrent inhibition replacing DNA in the complex with the restriction-modification enzyme. Based on the prepared in vitro mutant forms of ArdA and Ocr, and also on natural proteins ArdA selectively inhibiting restriction activity of the type I enzymes, but not affecting their methylase activity, we have developed a model of complex formation between the antirestriction proteins and the restriction-modification enzymes R2M2S. Antirestriction proteins are capable of competing displacement of the DNA strand from two sites which are situated as follows: 1) in S-subunit (enzyme contact with the specific DNA site) and 2) in R-sub-unit (through this unit translocation of the DNA strand occurs followed by its degradation). Analysis of antirestriction and antimodification activities of proteins ArdA and Ocr depending on the expression level of genes ard A and ocr was performed (the cloning of the genes was done under strictly regulated promoter).
Key words: the type I restriction-modification enzymes, antirestriction, ArdA, Ocr, transmissible plas-mid, bacteriophage, DNA mimicry.
* Эл. почта: zavilgel@genetika.ru
СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ ТИПА I
Системы рестрикции-модификации служат барьером против проникновения в клетку "чужих" молекул ДНК. Согласно современным представлениям, ферменты рестрикции-модификации входят в состав системы "иммиграционного контроля", обеспечивающего распознавание проникающих в клетку молекул ДНК как "своих" или "чужих". В основе явления рестрикции-модификации лежит сопряженное действие двух ферментативных активностей - рестрикционной эндонуклеазы и ДНК-метилтрансферазы. Ферменты рестрикции-модификации узнают специфическую нуклеотидную последовательность в ДНК, и рестрикционная эндо-нуклеаза индуцирует в немодифицированной ДНК двойные разрывы. Для защиты собственной ДНК от ферментативного расщепления используется специфическое метилирование узнаваемых последовательностей, которое осуществляют ДНК-ме-тилтрансферазы [1-4]. Ферменты рестрикции-модификации подразделяют на четыре типа. Отметим некоторые особенности действия систем рестрикции-модификации типа I, так как именно эти системы эффективно ингибируются антирестрикцион-ными белками (антирестриктазами).
Схематично действие фермента системы типа I (например, EcoKI) представлено на рис. 1. Фермент EcoKI состоит из пяти субъединиц, R2M2S: двух R-субъединиц (R - рестрикционная эндонуклеаза, индуцирует двойные разрывы в немодифицированной ДНК), двух M-субъединиц (M - метилтрансфераза, осуществляет метилирование адениловых остатков в сайте) и одной S-субъединицы, которая узнает специфический сайт (sK) в ДНК и формирует с ним прочный комплекс. Сайт sK относится к группе сайтов с "дефисом", т.е. из 13 н., входящих в состав сайта, лишь семь константные, они занимают краевые позиции. По данным футпринтинга фермент EcoKI покрывает 66 п.н. в цепи ДНК. Дальнейшие действия фермента зависят от состояния сайта sK. Если обе нити ДНК в сайте метилированы, то комплекс диссоциирует. Если одна нить метилирована, а вторая - нет, то метилаза (M) метилирует соответствующий адениловый остаток, и комплекс диссоциирует. Если же обе нити ДНК не метилированы, то происходит транслокация, т.е. протаскивание дву-спиральной ДНК через R-субъединицы, причем связь S-субъединицы с sK-сайтом сохраняется. Эндонуклеаза R расщепляет нить ДНК случайным образом на значительном расстоянии от сайта. Этим ферменты рестрикции-модификации типа I отличаются от рестриктаз типа II, которые делают двойные разрывы непосредственно в сайте узнавания или на строго фиксированном расстоянии от него. Сам процесс протаскивания нити ДНК через фермент требует значительных энергетических затрат в форме АТР. Соответственно ферменты рестрик-
ции-модификации типа I являются АТР-зависимы-ми, а типа II - АТР-независимыми. Отметим еще одну особенность комплекса EcoKI c sK-сайтом. S-субъединица связывается лишь с краевыми константными элементами сайта. В результате двуспи-ральная ДНК в этом месте подвергается деформации - значительному изгибу (или "кинку") примерно на 34°, что также требует энергетических затрат.
Последовательности нуклеотидов в сайтах узнавания варьируют, они характерны для каждого фермента типа I (EcoK, EcoB, EcoA, EcoD, Eco124, StyLT, StySP, CfrAI и много других). По гомологии и по способности обмениваться субъединицами стс-темы рестрикции-модификации типа I разделены на четыре семейства: IA, IB, IC, ID.
Рестрикция эффективна против чужеродной ДНК независимо от способа ее проникновения в клетку: при инъекции из фаговой головки, при трансформации или конъюгативном переносе. Таким образом, системы рестрикции-модификации типа I создают в клетке так называемый рестрикци-онный барьер, препятствуя межвидовому горизонтальному переносу генетического материала.
ПЛАЗМИДЫ, БАКТЕРИОФАГИ И АНТИРЕСТРИКЦИЯ
В природе горизонтальный перенос генов между бактериями осуществляется в основном с помощью конъюгативных плазмид и бактериофагов [5].
В процессе эволюции как у конъюгативных плазмид, так и у некоторых бактериофагов возникли системы, способствующие преодолению "ре-стрикционных барьеров". Это явление получило название антирестрикции [6, 7]. Исследование антире-стрикционных механизмов у конъюгативных плазмид показало, что в этом процессе участвует специальный белок - антирестриктаза, продукт гена ard (alleviation of restriction of DNA). Впервые гены ard были обнаружены в плазмидах N-группы несовместимости в 1984-1985 гг. [8, 9], а затем и в других плазмидах [10-12]. В течение 1991-1995 гг. гены ard секвенировали и определили первичную структуру белков Ard [12, 13]. Область конъюгативных плазмид, в которой располагаются гены ard, называется лидерной, так как она примыкает к сайту oriT, а ее гены первыми входят в клетку-реципиент при конъюгативном переносе. Сайт oriT - начало (origin) конъюгативной репликации - расположен на границе ira-оперона c остальной частью плазмиды.
Гены ard (к настоящему времени обнаружено несколько разновидностей этого гена, получивших индексы ardA, ardB, ardC) кодируют небольшие, очень кислые белки (размер 140-170 аминокислотных остатков) с характерным суммарным отрицательным зарядом (-10 : -30), которые являются специфическими высокоэффективными ингибиторами клеточных рестриктаз-метилтрансфераз типа I.
ДНК
CH3
I
SK-сайт
Ън3
ЗАВИЛЬГЕЛЬСКИИ, РАСТОРГУЕВ Принцип действия системы рестрикции-модификации
PvR )
Д11&R -
ДНК
CH3
I
SK-сайт
CH3
CH3
ДНК
SK-сайт
ДНК
ДНК
+ CH3
ДНК
+
ATP
ДНК
CH3
SK-сайт
CH3
ДНК
Рис. 1. Действие фермента рестрикции-модификации типа I на ДНК. 1 - Обе нити ДНК в сайте sK метилированы. Комплекс фермент-ДНК распадается. 2 - Одна из нитей ДНК в сайте sK метилирована. Метилаза (М) метилирует аде-ниловый остаток во второй нити, после чего комплекс фермент-ДНК распадается. 3 - Обе нити ДНК в сайте sK не-метилированы. Начинается транслокация (протаскивание) нити ДНК через R-субъединицы с формированием суперспиральной петли с последующим разрывом двойной цепи ДНК.
Белки Ard практически с равной эффек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.