АНТИТЕЛА К БЕНЗО[А]ПИРЕНУ, ЭСТРАДИОЛУ И ПРОГЕСТЕРОНУ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ CYP1A2*1F, GST T1 И GST M1 У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН С ВРОЖДЁННЫМИ ПОРОКАМИ РАЗВИТИЯ ПЛОДА

АНОСОВ М.П.; АНОСОВА Т.П.; ГЛУШКОВ А.Н.; ГОРДЕЕВА Л.А.; КОСТЯНКО М.В.; КРАСИЛЬНИКОВА К.С.; ПОЛЕНОК Е.Г.; ПОПОВА О.С.; ШАТАЛИНА И.В.; ШУТРОВ А.Е.

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2012, том 6(15), № 2, с. 162-169

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

АНТИТЕЛА К БЕНЗО[А]ПИРЕНУ, ЭСТРАДИОЛУ И ПРОГЕСТЕРОНУ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ CYP1A2*1F, GST T1 И GST M1 У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН С ВРОЖДЁННЫМИ ПОРОКАМИ РАЗВИТИЯ ПЛОДА

Отдел молекулярной экологии человека, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии человека Сибирского отделения РАН,

г. Кемерово, Россия

Поступила: 15.05.2012. Принята: 23.05.2012

Обследованы 171 женщина с физиологической беременностью и 102 беременные женщины с врождёнными пороками развития плода (ВПРП). Обнаружено, что при ВПРП высокие значения соотношений уровней антител к бензо[а]пирену и эстрадиолу (АТ-БП/ЭС) и к прогестерону (АТ-БП/ПГ) встречаются чаще, чем при физиологической беременности. Это происходит за счёт небольшого повышения уровней АТ-БП и выраженного снижения уровней АТ-ЭС и АТ-ПГ. Шансы возникновения ВПРП значительно выше при высоких значениях АТ-БП/ЭС и АТ-БП/ПГ в сочетании с делециями GST T1 и GST M1 у носителей аллеля С CYP1A2*1F.

Ключевые слова: антитела к бензо[а]пирену, генетический полиморфизм, врождённые пороки развития плода

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что некоторые метаболиты химических канцерогенов окружающей среды, в частности, бензо[а]пирена (БП), образуют аддукты с белками и ДНК человека [1, 2], в том числе в плаценте [3 — 5]. Основные геноток-сические производные эстрагенов (катехол-эстрагены) также способны к образованию аддуктов с ДНК [6, 7]. Сами по себе химические канцерогены и стероидные гормоны неиммуногенны. Однако в составе аддуктов с макромолекулами они становятся гаптенами и могут индуцировать синтез специфических антител (АТ). АТ к БП и к его аддуктам с ДНК обнаружены у здоровых людей и больных злокачественными опухолями [8—12]. АТ к прогестерону (ПГ) выявлены у женщин с привычным невынашиванием беременности [13,

14].

Адрес: 650065 Россия, г. Кемерово, пр. Ленинградский10. E-mail: ihe@list.ru

В свою очередь образование аддуктов зависит от активности ферментов биотрансформации низкомолекулярных органических соединений. Некоторым авторам [15—17] удалось обнаружить прямую взаимосвязь между количеством аддуктов, с одной стороны, и высокой активностью ферментов I фазы биотрансформации и/или низкой активностью ферментов II фазы биотрансформации (при анализе генетических полиморфизмов CYP и GST), с другой стороны.

Предполагается, что специфические иммунные реакции на химические канцерогены окружающей среды и эндогенные стероиды взаимосвязаны, поскольку пути их метаболизма, а значит и возможность образования аддуктов с макромолекулами организма, во многом схожи. В норме имеет место определённый баланс между уровнем АТ к низкомолекулярным органическим ксено- и эндо-биотикам. Нарушение такого баланса может способствовать возникновению злокачественных опухолей или врождённых пороков развития плода (ВПРП) [18, 19]. Однако до сих пор не проводилось исследований взаи-

мосвязей между образованием АТ к химическим канцерогенам и стероидным гормонам, с одной стороны, и активностью ферментов биотрансформации, с другой стороны.

Цель работы — изучить ассоциации уровней АТ к БП, эстрадиолу (ЭС) и ПГ с генетическим полиморфизмом CYP1A2* 1F, GST Tl и GST M1 у женщин с физиологической беременностью (ФБ) и с ВПРП.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследований послужила сыворотка венозной крови 273 беременных женщин, находящихся во II триместре беременности (13 — 27 недель гестации). По результатам ультразвукового исследования плода все женщины были поделены на 2 группы: 102 женщины вынашивали беременность с патологиями развития плода и были отнесены в группу с ВПРП. Среди них превалировали пороки сердечно-сосудистой (23,25%), моче-выделительной (20,7%), центральной нервной (18,3%), костно-мышечной систем (15,8%), а также множественные ВПРП (12,2%). 171 беременная женщина, являющиеся условно здоровыми, были отнесены в группу сравнения. УЗИ (скрининговое при сроке 10—13 недель и 20 — 24 недели и по клиническим показаниям с 12 по 29 недели) проводилось на базах ЛПУ II и III: ГКБ № 1, Городского и Областного перинатальных центров г. Кемерово.

АТ к БП, ЭС и ПГ определяли методом неконкурентного ИФА в собственной модификации [9]. Сыворотку крови в разведении 1 : 20 (для ^А-АТ), 1 : 100 (для ^-АТ) и 1 : 50 (для !дМ-АТ) вносили в лунки полистироловых планшетов с адсорбированными конью-гатами БП-, ЭС- и ПГ-бычий сывороточный альбумин (БП-БСА, ЭС-БСА и ПГ-БСА) и отдельно с БСА. Связывание АТ выявляли с помощью коньюгатов АТ кролика, специфичных к !дА, IgG и !дМ человека, с пероксидазой хрена. Уровень АТ, специфичных к ксено- и эндобиотикам, определяли по формулам:

АТ-БП = ^(БП-БСА) - OD(БCА))/OD(БCА),

АТ-Х = ^(Х-ВСА) - OD(БcА))/OD(БcА),

где OD — значение оптической плотности в соответствующих лунках, Х - эндобиотики ЭС или ПГ.

Соотношение уровней АТ ксенобиотик/ эндобиотик рассчитывали по формуле:

АТ-БП/Х =

= (0^БП-БСА) — 0^БСА))/(0^Х-БСА) —

Тест-системы для молекулярно-генетиче-ского анализа полиморфизмов генов биотрансформации CYP1A2* IF, GST T1 и GST Ml разработаны в ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск. Для проведения генотипирования проводился забор 5—10 мл венозной крови в пробирки с EDTA. Выделение ДНК проводили, используя фенол-хлороформную экстракцию [20], образцы ДНК растворяли в 10 mM Tris/1 EDTA, pH 8,0 и хранили при 4 oC.

Полиморфизм CYP1A2 возникает в результате точковой замены С734- > А. Используя фермент Ара1 в ПДРФ, данная замена обнаруживается [21]. Перед проведением ПДРФ проводилась амплификация специфического района 1-го интрона. Смесь для амплификации объемом 15 мкл включала 1,5 мкл 10* каждого праймера (antisense 5'-AGAAGCTCTGTGGCCGAGAAGG-3';), 1,5 мкл 10* ПЦР буфера (10 мМ трис-НС1; рН 8,3; 1,5 мМ MgC12; 50 мМ KCl), 0,2 мМ каждого dNTP и 0,5 ед. Taq-полимеразы и 1,5 мкл геномной ДНК. Полимеразная цепная реакция проводилась при следующих температурных условиях: 3 мин — денатурации при 95 °С, за которой следовали 35 циклов амплификации в режиме 95 °С — 30 сек, 62 °С — 30 сек, 72 °С — 1 мин. ПЦР была терминирована при 72 °С в течение 10 мин, с последующим охлаждением до 4 °С. Амплифицированные фрагменты ДНК были смешаны с ферментом ApaI. Продукты рестрикции анализировали в 8% ПААГ с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией фрагментов в проходящем УФ-свете.

Частоту нулевых аллелей (делеция участка гена) GST T1 и GST M1 также исследовали методом ПЦР. Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 2,5 мкл 10* каждого праймера, 2,5 мкл 10* ПЦР буфера (10 мМ трис-НС1, рН 8,3, 1,5 мМ MgC12, 50 мМ KCl), 0,2 мМ каждого dNTP и 0,5 ед. Taq-полиме-разы и 5 мкл геномной ДНК. Для амплификации фрагментов генов GST T1 (GSTT1 F TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC; GSTT1 R TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA) и GST M1 (GSTM1 F GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C; GSTM1 R GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G) использовали следующие условия ПЦР: после денатурации (95 °С, 3 мин) проводили 15 циклов амплификации в режиме 95 °С — 12 сек; 65 °С — 10 сек; 72 °С — 12 сек; далее 20 циклов в режиме 95 °С — 7 сек; 62 °С — 7 сек; 72 °С — 12 сек. ПЦР была терминирована при 72 °С в течение 3 мин, с последующим охлаждением до 4 °С. После амплификации анализировали продукты реакции в 1,5%

агарозном геле с последующей визализаци-ей в проходящем УФ-свете. Гомозиготы по нормальному аллелю «+» определяли по наличию на электрофореграммах продукта амплификации размером 315 н.п. для GST T1 и фрагмента 271 н.п. для GST M1. Отсутствие соответствующего фрагмента указывало на гомозиготность индивидуума по делеции гена [20].

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ STATISTICA 6,0. С использованием критерия Шапиро —Уилка был выявлен ненормальный характер распределения выборки и в дальнейшем оценку статистической значимости различий между группами проводили при помощи непараметрического U-кри-терия Манна Уитни и критерия х2 с поправкой Йетса для непрерывной вариации. Относительные шансы ^R) рассчитывали по методу [22] с доверительным интервалом (CI) при 95%-ном уровне значимости. Определение критических точек — границы между нормой и патологией по выявленным значениям соотношений уровней АТ-БП/ЭС и АТ-БП/ ПГ — проводилось с применением ROC-ана-лиза [23].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Антитела к бензо[а]пирену, эстрадиолу и прогестерону у беременных женщин с врождёнными пороками развития плода

Наиболее выраженные и статистически значимые различия между женщинами с ФБ и ВПРП обнаружены по соотношениям уровней АТ-БП/ЭС и АТ-БП/ПГ. По табл. 1 видно, что медианы указанных соотношений для

Таблица 1. Медианы соотношений уровней АТ-БП/ЭС и АТ-БП/ПГ у женщин с ФБ и с ВПРП

АТ ФБ ВПРП Р (М-U test)

1. IgA-БП/ЭС 1,1 1,6 0,0012

2. IgG-БП/ЭС 1,0 1,4 0,000065

3. IgM-БП/ЭС 2,4 3,25 0,003

4. IgA-БП/ПГ 1,3 2,9 0,0000001

5. IgG-БП/ПГ 1,9 2,15 0,0055

6. IgM-БП/ПГ 1,4 3,4 0,0000001

1дА-, ДО-, 1дМ-БП/ЭС и -БП/ПГ при ВПРП превышают соответствующие показатели в норме в 1,2 — 2,5 раза.

Применив ROC-анализ, определили критические точки — границы между нормой и патологией по выявленным значениям соотношений уровней АТ-БП/ЭС и АТ-БП/ПГ в обследуемых группах. Рассчитали шансы возникновения ВПРП (OR) при значениях выявленных соотношений АТ, превышающих определённые критические точки. Полученные результаты представлены в табл. 2. Повышенные (> 2) значения соотношений АТ-БП/ ЭС и АТ-БП/ПГ значимо чаще обнаружены у женщин с ВПРП. При этом OR достигает 1,9 — 5,9. Пониженные (< 2) соотношения чаще наблюдаются у женщин с ФБ. Соответственно, на такую же величину повышается OR для ФБ.

Возникает вопрос, за счёт чего происходят повышения соотношений уровней АТ-БП и АТ к стероидным гормонам. В табл. 3 приведены медианы уровней АТ при низких и высоких значениях этих соотношений. Видно, что в каждом без исключения случае повышенные значения достигаются за счёт значительного, в 2 — 3 раза, сниж

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.