ш
УДК 576.08
АНТИТЕЛА К СИНТЕТИЧЕСКОМУ ФРАГМЕНТУ 95-123 ПРИОННОГО БЕЛКА ПРЕДОХРАНЯЮТ НЕЙРОНЫ И АСТРОЦИТЫ ОТ ИНДУЦИРОВАННОЙ БЕТА-АМИЛОИДОМ ГИБЕЛИ
© 2013 г. А. В. Камынина*, #, М. П. Филатова*, Д. О. Короев*, А. Ю. Абрамов**, О. М. Вольпина*
* Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Москва, Россия ** Институт нейрологии, Университетский колледж Лондона,
Queen Square, London WC1N 3BG, Великобритания Поступила в редакцию 20.08.2012 г. Принята к печати 16.10.2012 г.
Известно, что при болезни Альцгеймера токсическое действие бета-амилоида на клетки мозга ассоциировано с такими молекулярными изменениями, как оксидативный стресс, увеличение внутриклеточной концентрации Ca2+ в нейронах и астроцитах, а также активация продукции свободных радикалов в астроцитах. Прионный белок может служить посредником для токсического действия бета-амилоида. В работе исследовано влияние аффинноочищенных антител к фрагменту 95—123 прионного белка (PrP-(95-123)) на индуцированную бета-амилоидом гибель нейронов и астроци-тов, а также на изменения внутриклеточной концентрации кальция (Са2+-сигнал), производство свободных радикалов и активацию каспазы 3. Впервые показано, что антитела к РгР-(95-123)-фраг-менту предохраняют нейроны и астроциты от индуцированной бета-амилоидом гибели, не изменяя внутриклеточную концентрацию Са2+ под действием бета-амилоида. При этом протективное действие антител к прионному белку сопровождается понижением продукции активных форм, индуцированных бета-амилоидом в астроцитах, а также замедлением активации каспазы 3 в нейронах и астроцитах. Таким образом, индукция антител к синтетическому РгР-(95-123)-фрагменту может служить перспективным подходом к терапии болезни Альцгеймера.
Ключевые слова: синтетический пептид, прионный белок, болезнь Альцгеймера, клеточные культуры, активные формы кислорода.
Б01: 10.7868/80132342313020073
ВВЕДЕНИЕ
Одной из причин развития болезни Альцгеймера считается накопление в мозге патогенного пептида — Р-амилоида размером 40 или 42 аминокислотных остатка в агрегированной форме и его токсическое действие на клетки мозга, приводящее к снижению памяти и развитию когнитивных отклонений. На молекулярном уровне болезнь Альц-геймера характеризуется дегенеративными процессами внутри клеток, такими как оксидативный стресс и образование свободных радикалов [1], на-
Сокращения: AP — бета-амилоид; Ahx — s-аминогексано-вая кислота; AEBSF — 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонил-фторид; PBS — буфер, содержащий 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 7.8 мМ Na2HPO4, 1.5 мМ KH2PO4, pH 7; PrP - прионный белок; АФК — активные формы кислорода; КРС — крупный рогатый скот; МА — моноспецифические антитела; НАФ — неполный адъювант Фрейнда; ПАФ — полный адъювант Фрейнда.
# Автор для связи: (тел.: 8 (495) 336-57-77; e-mail: aneskaminina@mail.ru).
рушения во внутриклеточном гомеостазе ионов Са2+ в нейронах и глиальных клетках [2, 3], активация микроглии, и другими процессами, приводящими к гибели клеток. Было выявлено, что прионный белок часто обнаруживается в мозге больных рядом с отложениями Р-амилоидного пептида [4]. Более детальные исследования показали, что растворимые олигомеры бета-амилоида связываются с прионом, что приводит к нарушению синаптической пластичности и развитию признаков болезни Альцгеймера у трансгенных животных. Был выявлен участок 95-110 последовательности прионного белка (PrP-(95-110)), играющий важную роль в его связывании с Р-ами-лоидом [5].
Показано, что моноклональные антитела, к фрагменту PrP-(95-110) эффективно восстанавливали память трансгенных мышей и предотвращали связывание Р-амилоида с прионом, исследованное в опытах in vivo [6]. Однако опыты на
Таблица 1. Синтетические пептиды
Фрагмент Аминокислотная последовательность
PrP-(95-123) PrP-(95-110)-rr 95TH G QWNKPSKPKTN M KHVAGAAAAGAVVG123 95THN QWNKPSKPKTN L K110-Ahx-830QYIKANSKFIGITEL844 КРС Крыса
ТТ — фрагмент 830-844 белка токсина столбняка. Межвидовые различия выделены серым цветом.
животных не объясняли механизм наблюдаемого эффекта антител, а работы по изучению более детальных механизмов протективного действия антител на клеточных культурах не были проведены. В связи с этим мы предложили исследовать действие моноспецифических аффинноочищен-ных антител, полученных к фрагменту PrP-(95-123) (PrP-(95-123)-MA), также и на зараженную Р-амилоидом первичную культуру нейронов и аст-роцитов мозга крыс. Ранее было показано, что антитела к фрагменту PrP-(95-123), представляющему собой удлиненный аналог активного участка PrP-(95-110), связывались с рекомбинантным прионом, а также с природным прионным белком и оказались эффективными в предотвращении развития прионных инфекций на клеточных линиях [7]. Целью данной работы явилось исследование действия полученных МА к PrP-(95-123)-фрагменту, на проявления Ар-токсичности в культурах нейронов и астроцитов коры и гиппокампа крыс.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Синтетические пептиды и получение противо-пептидной сыворотки. Для иммунизации животных был использован пептид с последовательностью фрагмента 95-123 приона крупного рогатого скота (КРС) (табл. 1). Для характеристики аф-финноочищенных антител к этому пептиду с помощью ИФА была использована пептидная конструкция PrP-(95-110)—TT, состоящая из участка 95-110 приона крысы, соединенного с фрагментом 830-844 белка токсина столбняка (titanus toxoid, ТТ) [8] через остаток s-аминогексановой кислоты (табл. 1). Пептиды были синтезированы твердофазным методом и охарактеризованы с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии.
Для проведения исследований необходимо было получить большое количество противопептид-ных антител к PrP-(95-123)-пептиду. Ранее было показано, что иммунизация кроликов свободным пептидом PrP-(95-123) не стимулировала образования высокого уровня антител [7]. Известно, что использование конъюгатов пептидных фрамген-тов с высокомолекулярным белком-носителем повышает их иммуногенную активность [9]. Поэтому в настоящей работе мы иммунизировали кроликов пептидом PrP-(95-123), конъюгированным с гемо-
цианином улитки (KLH). В результате двукратной иммунизации получено 12 мл сыворотки крови с титром противопептидных антител 1 : 2560.
Получение аффинноочищенных антител к фрагменту PrP-(95-123) и их характеристика. Для получения моноспецифических противопептидных антител была проведена аффинная очистка антител на сефарозе 4В с иммобилизованным Prp-(95-123)-пептидом. В результате аффинной очистки получили моноспецифические противопептид-ные антитела, которые диализовали против PBS и лиофилизовали. Сухое вещество растворяли в дистиллированной воде до концентрации антител 1.2 мг/мл. Титр антител составил 1 : 1280.
Выделенные Prp-(95-123)-MA были специфичны к фрагменту 95-123 прионного белка КРС. Для дальнейших исследований на первичных культурах клеток, выделенных из мозга крысы, нам необходимо было показать, что полученные антитела связываются и с последовательностью приона крысы. Для этого с помощью ИФА изучали связывание Prp-(95-123)-MA с последовательностью 95110 прионного белка крысы в составе пептидной конструкции PrP-(95-110)-TT (табл.1), которая была синтезирована для последующего изучения ее активности в опытах in vivo. Проведенные исследования показали, что замена концевого фрагмента в аминокислотной последовательности 95123 не влияли на связывание противопептидных антител с крысиным аналогом — антитела, полученные к Prp-(95-123)-фрагменту КРС, не теряли способность связываться с фрагментом 95-110, связанным с ТТ (титр антител составил 1 : 1280). Таким образом, мы полагаем, что в исследованиях на культурах клеток мозга крысы полученные антитела могут связываться с прионным белком, препятствуя его взаимодействию с Р-амилоидом.
Следует отметить, что при проведении опытов in vitro важно было исключить возможность связывания Prp-(95-123)-MA с самим Р-амилоидом. В связи с этим, методом ИФА было выявлено, что антитела не связываются с полноразмерным AP-(1-42) (титр составил <1 : 40). Поскольку Prp-(95-123)-МА не связываются с Ap-(1-42), то, они также не будут связываться и с А0-(1-40) и с укороченным фрагментом Ар-(25-35), использованными в последующих опытах.
Действие аффинноочищеннъх кроличьих антител к PrP-(95-123)-фрагменту на клеточную гибель, вызванную ß-амилоидом. Было проведено исследование токсического действия ß-амилоида на смешанную культуру нейронов и астроцитов гиппокампа, полученных из новорожденных крыс. Для исследования клеточной гибели под действием ß-амилоида использовали флуоресцентные красители пропидиум иодид и Hoechst 33342. Пропидиум иодид проникает только через разрушенные мембраны мертвых клеток, связывается с ДНК и дает свечение в красной области спектра. Hoechst 33342 дает голубое свечение и окрашивает хроматин всех клеток.
Было обнаружено, что 24-часовая обработка культуры Aß-^^^^^^^ приводила к более значительной гибели нейронов и астроцитов (30.2 ± 7.5%) по сравнению с контрольными культурами, не обработанными ß-амилоидным пептидом (табл. 2), что согласуется с ранее полученными данными [10]. Следует отметить, что в связи с морфологическими изменениями клеток после инкубации с ß-амилоидом визуально сложно было точно определить, гибель каких именно клеток (нейронов или астроцитов) в культуре была выше.
Далее мы исследовали влияние PrP-(95-123)-МА на индуцированную ß-амилоидом клеточную гибель. Было показано, что предварительная обработка клеток антителами в концентрации 20 мкг/мл приводила к снижению гибели клеток, обработанных Aß-(25-35), которая составила18.6 ± ± 1.5%. Таким образом, было установлено, что РгР-(95-123)-МА обладают ярко выраженным защитным эффектом против действия ß-амилоидом в первичных культурах клеток.
Действие аффиноочищеннъх кроличьих антител к РгР-(95-123)-фрагменту на Са2+-сигнал в астроцитах и нейронах. В целях изучения клеточного механизма защиты нейронов и астроцитов от токсического действия ß-амилоида мы провели серию экспериментов по выявлению влияния РгР-(95-123)-МА на индуцированные ß-амилои-дом изменения Са2+
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.