БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып.. 11, с. 1547 - 1560
УДК 577.155.2
АНТИТЕЛА ПРОТИВ ДНК ГИДРОЛИЗУЮТ ДНК И РНК*
© 2008 г. М.А. Красноруцкий, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский**
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8; факс: +7(383)333-3677, электронная почта: nevinsky@niboch.nsc.ru
Поступила в редакцию 29.01.08 После доработки 30.05.08
Проведена иммунизация кроликов комплексом высокополимерной ДНК с метилированным БСА (мБСА) и мБСА. Показано, что электрофоретически гомогенные препараты поликлональных антител (АТ) от неим-мунизированных кроликов и животных, иммунизированных мБСА, каталитической активностью не обладают. Отмечено, что АТ из крови кроликов, иммунизированных комплексом ДНК с мБСА, гидролизовали на 3—4 порядка эффективнее ро1у(С) и другие РНК, чем ДНК. Аффинная хроматография на ДНК-целлюлозе привела к разделению АТ на фракции, гидролизующие как РНК, так и ДНК, причем впервые обнаружены фракции, гидролизующие только РНК. Проведено сравнение кинетических параметров, характеризующих гидролиз РНК и ДНК исходными препаратами АТ, а также их фракциями, полученными после разделения на аффинном сорбенте.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: иммунизация кроликов ДНК, ДНК- и РНК-гидролизующие абзимы.
Антитела (АТ) против стабильных аналогов переходных состояний химических реакций, а также природные иммуноглобулины с каталитическими активностями названы абзимами и достаточно хорошо описаны в литературе (см. монографию [1] и ссылки в ней). Первым примером природных абзимов были выделенные из крови больных бронхиальной астмой гидролизующие У1Р [2]. Известно, что в крови здоровых доноров могут содержаться поликлональ-ные ауто-АТ к различным антигенам [3, 4]. В то же время относительное количество ауто-АТ существенно выше в крови людей с различными аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) [3, 4], а наличие в крови АТ с различными каталитическими активностями является характеристикой именно АИЗ [1, 5—9]. Описаны ^О и/или 1яМ, а также ]^А, гидролизующие ДНК, РНК, белки и полисахариды, выделенные из крови пациентов с различными АИЗ (СКВ, тиреоидит Хаши-
Принятые сокращения: АИЗ — аутоиммунные заболевания; НК — нуклеиновые кислоты; АТ — антитела; пАТ — поликлональные АТ; pIgG — поликлональные IgG; ссДНК и рДНК — суперскрученная и релаксированная ДНК соответственно; VIP — вазоактивный нейропептид; ОА — относительная активность; СКВ — системная красная волчанка.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 08-028, 12.10.2008.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
мото, полиартрит, рассеянный склероз), а также лимфопролиферативными и некоторыми вирусными заболеваниями (вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция [1, 5—9]). АТ из крови здоровых доноров, а также больных гриппом, тонзиллитом, язвой 12-перстной кишки и некоторыми другими заболеваниями (раки матки, кишечника), протекающими без сильных нарушений иммунного статуса, не проявляли заметной ДНКазной активности [10, 11].
Согласно сложившимся представлениям существуют два пути образования абзимов. С одной стороны, подобно искусственным абзимам против стабильных аналогов переходных состояний химических реакций, природные абзимы могут нарабатываться непосредственно против антигена, который в определенных состояниях может имитировать переходное состояние [1]. Например, абзимы, специфически гидролизующие У1Р (астма) [2], тиреоглобулин (аутоиммунный тиреоидит) [12] и основной белок миелина (рассеянный склероз) [13], являются АТ непосредственно против этих белков. АТ могут нарабатываться непосредственно против ДНК и РНК в комплексах с белками, тогда как НК сами по себе являются слабыми иммуногенами. В случае СКВ анти-ДНК и анти-РНК-антитела получаются в результате аутоиммунизации млекопитающих комплексами ДНК и РНК с различными белками, включая гистоны, которые появля-
1547
ются в крови в результате апоптоза клеток [14]. Эти АТ могут обладать нуклеазной активностью [9]. С другой стороны, абзимами могут быть ан-тиидиотипические АТ [15—17]. Если идиотипи-ческие АТ направлены против активного центра фермента, соответствующие им вторичные ан-тиидиотипические АТ могут иметь структурные характеристики активного центра исходного фермента. Особенности образования идиотипи-ческих и антиидиотипических АТ в соответствии с теорией Эрне были использованы для получения моноклональных АТ с ацетилхолинэстераз-ной [17, 18], карбоксипептидазной [19, 20] и р-лактамазной [21] активностями. Предполагается, что кровь пациентов с СКВ может содержать ДНК-гидролизующие АТ против топоизомеразы I [22]. Показано, что иммунизация кроликов с помощью ДНКазы I ведет к наработке идиотипи-ческих АТ1 [23]. Поликлональные антиидиоти-пические АТ2, полученные против изолированных АТ1, обладали ДНКазной активностью.
Известно, что канонические ДНКазы гидро-лизуют только ДНК и не проявляют активности в гидролизе РНК, а РНКазы не способны гидро-лизовать ДНК. В то же время поликлональные ^О, 1^, и ^М, выделенные из крови пациентов с большим числом различных АИЗ и молока здоровых женщин, более эффективно гидролизуют РНК, чем ДНК [2—6, 24—27]. В работе [28] показано, что молока человека гидролизуют рибосомальную РНК. Более того, несколько различных моноклональных ^О против различных последовательностей В-ДНК, полученные с использованием СКВ линии мышей, в 30—100 раз быстрее гидролизовали РНК, чем ДНК [29]. В целом очевидно, что поликлональные ДНК-гидролизующие АТ у пациентов с АИЗ могут содержать абзимы как против ДНК, так и против различных ДНКаз [5—9]. Однако пока остаются до конца не выясненными механизмы наработки абзимов с РНКазной активностью: приводит ли аутоиммуннизация с помощью ДНК только к образованию полифункциональных абзимов, способных гидролизовать как ДНК, так и РНК, или возможно параллельное образование обладающих только ДНКаз-ной или только РНКазной активностью. Также не ясно, могут ли нарабатываться АТ с РНКаз-ной активностью, имеющие антиидиотипичес-кую природу. Для выяснения этого вопроса мы провели иммунизацию кроликов с помощью ДНКазы I, ДНКазы II, РНКазы А и комплексов мБСА с ДНК и РНК и сравнили относительные активности полученных АТ в гидролизе ДНК и РНК. Было показано, что во всех случаях происходит образование р^О, эффективно гидроли-зующих как РНК, так и ДНК. Соотношение
этих активностей и сродство АТ к ДНК и РНК сильно различаются в зависимости от использованного антигена (данные по каждому антигену будут опубликованы отдельно).
Цель данной работы — анализ энзимологи-ческих особенностей АТ, полученных при иммунизации кроликов ДНК.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммунизация кроликов. Здоровые кролики (трехмесячные) были иммунизированы комплексом ДНК с мБСА (200 мкг высокополимерной ДНК (свободной от РНК) из тимуса теленка на 200 г веса животного с использованием физиологического раствора (0,85% NaCl, 0,02 М NaH2PO4, pH 7,2)). мБСА является классическим положительно заряженным белком, образующим прочные комплексы с нуклеиновыми кислотами и повышающим их иммуногенность. Использовали смесь, состоявшую из 0,5 объема полного адъюванта Фрейнда и 0,5 объема раствора антигена. Смесь перемешивали до образования однородного геля и вводили подкожно в области шеи. Две повторные иммунизации проводили смесью с неполным адъювантом Фрейн-да через 21 и 30 сут. Анализ результатов иммунизации проводили через три месяца после первой иммунизации. Кровь неиммунизированных кроликов и животных, иммунизированных мБСА, использовали в качестве контроля.
Выделение антител из крови кроликов. АТ из крови мышей очищали с помощью модифицированной методики, разработанной ранее для выделения абзимов из крови пациентов с АИЗ [10, 11, 26, 27]. Для осаждения белков к плазме крови добавляли сульфат аммония до 50% насыщения, раствор выдерживали при 4° в течение 1—2 сут и белок отделяли центрифугированием (12 000 об/мин, 10 мин), осадок растворяли в исходном объеме TBS (0,15 M NaCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5). Полученный раствор наносили на колонку с протеин А-сефарозой (5 мл), уравновешенной TBS, и затем промывали 15 мл TBS. Неспецифически адсорбированные белки и ли-пиды элюировали TBS, содержавшим 0,5% Triton X-100 и 0,3 М NaCl. Фракции IgG элюировали 40 мМ глицин-НО-буфером, pH 2,6, и собирали в охлажденные пробирки, содержавшие 50 мкл 1,0 М Tris-HCl-буфера, pH 9,0. Затем растворы подтитровывали этим буфером до нейтрального рН. Белок центральной части пика был сконцентрирован и использован для проведения следующей стадии очистки.
Отделение IgG от IgA и IgM проводили с помощью высокоэффективной гель-фильтрации
на колонке Superdex 200 HR 10/30 (100 х 300 мм) (хроматограф Sprint Biocad, «Pharmacia», США), уравновешенной 50 мМ Tris-HCl-буфером, pH 7,5, как описано в работе [30]. Перед нанесением образца (0,2—0,3 мл) на колонку его инкубировали в течение 30 мин при 20° (TBS, содержавший 2,5 М MgCl2). На колонку перед введением образца наносили 2 мл буфера, содержавшего 3 М MgCl2, а затем раствор АТ. Элюцию проводили TBS-буфером (0,2 мл/мин). Для защиты от загрязнений фракции АТ пропускали через фильтры Millex filter («Millipore», США) (размер пор 0,2 мкм) и использовали для анализа после хранения в нейтральном буфере в течение недели при 4°.
Аффинную хроматографию очищенных IgG на сефарозе с иммобилизованными монокло-нальными мышиными IgG против легких цепей IgG кролика проводили по аналогии с хроматографией АТ на протеин А-сефарозе. Отсутствие IgA и IgM в препаратах IgG было подтверждено с помощью иммуноблоттинга [26, 27].
Определение активности АТ в реакции гидролиза ДНК. Стандартная реакционная смесь (20 мкл) содержала 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 13,3 мкг/мл (4,43 нМ) плаз-мидной ДНК рBluescript и 0,005—0,2 мг/мл АТ. После инкубации смеси в течение 3—24 ч при 30° к реакционной смеси добавляли 5 мкл раствора 0,05%-ного бромфенолового синего, содержавшего 50%-ный глицерин, 20 мМ Tris-HCl-буфер, рН 7,5. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 0,8%-ном ага-розном геле (буфе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.