ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 1, с. 113-118
УДК 677.47.3
АНТИВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ХИТОЗАНОВ: ЗАВИСИМОСТЬ ОТ СТРУКТУРЫ И СПОСОБА ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИИ
© 2011 г. В. Н. Давыдова, В. П. Нагорская, В. И. Горбач, А. А. Калитник, А. В. Реунов, Т. Ф. Соловьёва, И. М. Ермак
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток, 690022
e-mail: piboc@eastnet.febras.ru Поступила в редакцию 21.11.2009 г.
Проведен ферментативный (действие лизоцима) и химический (пероксид водорода) гидролиз хито-занов с различной степенью ацетилирования (СА): 25, 17, 1.5%. Очистку и фракционирование продуктов гидролизов проводили методами диализа, ультрафильтрации и гельпроникающей хроматографии. Получены низкомолекулярные (НМ) производные полисахарида с молекулярными массами от 17 до 2 кДа. Изучена их антивирусная активность в отношении вируса табачной мозаики (ВТМ) и показано, что данные образцы ингибируют образование локальных некрозов, индуцированных вирусом, на 50—90%. Антивирусная активность НМ-хитозанов существенно возрастает с уменьшением степени их полимеризации. При этом продукты ферментативного гидролиза обладают меньшей активностью, чем образцы хитозанов, полученные в результате химического гидролиза. Установлено, что проявление антивирусной активности слабо зависит от степени ацетилирова-ния образцов.
Хитозан (деацетилированное производное хитина) — нетоксичный, биоразрушаемый, биосовместимый полисахарид — обладает разнообразной биологической активностью, включая антибактериальную, антивирусную, антиопухолевую, антихолестериновую и др., что обеспечивает возможность его широкого использования в медицине и фармации [1]. Значительный интерес вызывает иммуностимулирующая способность хитозана, позволяющая использовать это соединение в защите организмов от стрессовых воздействий и различных заболеваний [2].
В последние годы все большее внимание исследователей привлекает способность хитозана повышать устойчивость растений к вирусам [3—8]. Показано, что хитозан может уменьшать число и размеры вирусиндуцированных локальных некрозов на листьях сверхчувствительных растений-хозяев, а также ингибировать распространение вирусов в системно поражаемых растениях [4].
По имеющимся данным, уровень противовирусной устойчивости, индуцированной хитозаном, зависит от вида растения [4]. В то же время антивирусная активность хитозана определяется его структурой и, прежде всего, степенью полимеризации молекулы [9—11]. Так, сообщалось [9], что высокополимерные препараты полисахарида обладают более высокой противовирусной активностью. С другой стороны, было показано [10, 11], что ферментативная деградация высокополимерных хитозанов хитиназами гриба Aspergillus fumigatus значительно повышает их антивирусную активность, что выра-
жается в подавлении местных некрозов, образующихся при инокуляции листьев табака вирусом табачной мозаики (ВТМ).
Таким образом, данные о зависимости антивирусной активности хитозана от его структуры, в частности степени полимеризации, достаточно противоречивы, что может быть обусловлено разнообразием источников выделения хитозана [4]. Более того, образцы хитозана, выделенные из одних и тех же источников, имеют различные физико-химические характеристики (молекулярная масса, количество и характер распределения ацетатных групп в полимерной цепи), что может являться причиной расхождения данных по биологической активности этих полисахаридов [12, 13].
Известно, что практическое применение коммерческого хитозана ограничено высокой вязкостью его растворов и плохой растворимостью в воде. Он, как правило, растворим при низких значениях рН, но не растворим в нейтральных и основных растворах. Для получения водорастворимых образцов полисахарида проводят деполимеризацию хитозана химическим или ферментативным гидролизом. Способы деполимеризации исходных высокомолекулярных (ВМ) образцов хитозана и методы очистки также могут влиять на биологическую активность его НМ-произ-водных [14].
Одним из наиболее простых и распространенных способов химической деполимеризации хито-зана является гидролиз под действием пероксида водорода. Однако этот процесс зависит от условий протекания реакции и, наряду с получением оли-
госахаридов с низкой молекулярной массой, может приводить к образованию побочных продуктов реакции, способных вызывать изменение биологических свойств НМ-производных. Так, было показано, что противовирусная активность продуктов химического гидролиза хитозана увеличивается с ростом молекулярной массы [14], в то время как активность олигомеров хитозана, полученных ферментативным гидролизом, падает с увеличением их молекулярной массы [5]. Предполагается [14], что повышение антибактериальной активности НМ-образцов хитозана, в случае химического гидролиза, обусловливается не столько изменением степени полимеризации полисахарида, сколько появлением окисленных групп на олигомерных молекулах. В отличие от химического гидролиза, деполимеризация под действием ферментов исключает возможность появления окисленных групп в олигосахаридах. Вместе с тем образцы НМ-хито-занов, полученные с помощью химического и ферментативного гидролиза из одного и того же источника, могут различаться по распределению ацетатных остатков [15], что также будет влиять на проявление их биологической активности.
Цель работы — получение НМ-образцов хитоза-на разной степени ацетилирования с помощью ферментативного и химического гидролиза и изучение взаимосвязи их физико-химических характеристик (молекулярная масса, количество N-ацетат-ных групп) с антивирусной активностью.
МЕТОДИКА
Материалы. Использовали коммерческий хито-зан (ООО "Биополимеры" г. Партизанск, Россия); хитозан, выделенный в ТИБОХ ДВО РАН из панциря камчатского краба; лизоцим из куриного яйца, активность 20 х 103 ед., рНопт 6.24, ("Applichem GmbH", Германия); сефадекс G-50 ("Pharmacia", Швеция); мембраны для ультрафильтрации ("Milli-pore", США); диализные мешки ("Orange Scientific", Бельгия). Все остальные реактивы имели классификацию х.ч. ("Реахим", Россия) и использовались без дополнительной очистки.
Аналитические методы. Спектры 1Н-ЯМР полисахаридов получены на приборе DPX-300 (75.46 МГц) ("Bruker", Германия) в растворе D2O при 60°С. В качестве внутреннего стандарта использовали уксусную кислоту (5 = 23.52 относительно тетраметил-силана). Степень N-ацетилирования (СА) НМ-об-разцов хитозанов определяли согласно методике, приведенной в работе [16]. ИК-спектры исследуемых образцов регистрировали на спектрофотометре Vctor 22 ("Bruker", Германия) с разрешением 4 см-1. СА высокомолекулярных хитозанов определяли по методу Доузи [17].
Содержание белка в хитозанах определяли по методу Лоури [18]. Молекулярные массы (ММ)
образцов рассчитывали по методу, основанному на реакции восстанавливающих Сахаров с ферроци-анидом [19], или вискозиметрическим методом [20] используя уравнение Марка—Хаувинка—Куна:
М = кмыа,
где | п | — характериситческая вязкость, М — молекулярная масса, КМ и а — эмпирические константы, значения которых взяты из работы [21]. Вязкость растворов определяли в модифицированном вискозиметре Убеллоде (СКБ "Пущино") с диаметром капилляра 0.3 мм в 0.1 М СН3СООН-О.2 М ШС1.
Дезацетилирование хитозана. Хитозан со СА 17% и ММ 300 кДа, определенной вискозиметрическим методом, дезацетилировали по методике [22].
Химический гидролиз. Гидролиз пероксидом водорода проводили при 25 и 37°С, как описано ранее [23].
Ферментативный гидролиз. Растворяли 2 г ВМ-хи-тозана в 200 мл 1 М СН3СООН, разбавляли до 400 мл 0.4 М №С1 и доводили рН среды до 6.0 с помощью №ОН, добавляли раствор лизоцима (1 мг/мл) в 0.1 М КС1 из расчета 10 мг фермента на 1 г хитозана. Реакционную смесь выдерживали при 37°С. Каждые 20 мин из раствора отбирали аликвоты и определяли вязкость при 25°С. В момент соответствия вязкости гидролизу-емого раствора вязкости образца, полученного химическим гидролизом при 25°С, реакционную смесь охлаждали до 25°С, доводили до рН 10.0 добавлением 6 М №ОН и делили на 2 части. Одну часть кипятили 30 мин для инактивации фермента нагреванием, затем осаждали полисахарид этанолом. Во второй части фермент инактивировали обработкой этанолом. Осадки отделяли центрифугированием при 2500 §, растворяли в воде при добавлении 1 М СН3СООН и диализовали против воды в течение 48 ч.
НМ хитозан последовательно фракционировали с помощью диализных мешков MWCO 12000— 14000 и 3500 и ультрафильтрационной мембраны (РеШсоп, 1000, МБИроге). К фракции хитозана с ММ выше 14 кДа добавляли 1 мл раствора лизоцима (1 мг/мл), смесь выдерживали 24 ч при 37°С, после чего проводили инактивацию фермента двумя способами, описанными выше, ультрафильтрацию и диализ продуктов гидролиза.
Гельпроникающая хроматография. Для очистки хи-тозанов и их фракционирования по молекулярным массам использовали метод гельпроникающей хроматографии на колонке с сефадексом G-50. Полисахарид (20 мг) растворяли в 0.1 М СН3С00Н-0.2 М №С1 буфере, наносили на колонку (24 х 1.5 см), элюировали тем же буфером и собирали фракции объемом 2.5 мл. Калибровку колонки проводили декстранами с ММ 10 и 20 кДа и ламинараном с ММ 6 кДа. Содержание полисахаридов в собранных фракциях определяли по реакции аминогруппы хитозана с тринитробензолсульфокислотой [24].
Образцы хитозана лиофилизовали. Относительное содержание ацетатных групп в образцах определяли с помощью ЯМР-спектроскопии.
Антивирусная активность. Антивирусную активность препаратов хитозана оценивали по отношению к штамму ВТМ, выделенному из зараженных растений Мевйапа 1аЬаеыт Ь. сорта Самсун по методике Отсуки и др. [25]. Исследования проводили на локально поражаемых ВТМ листьях 4-недельных растений N. 1аЬаеыт Ь. сорта Ксанти-нк, выращенных в теплице. Листья среднего яруса отделяли от растений, разрезали вдоль средней жилки и напыляли карборундом. Затем опытные половинки листьев инокулировали смесью вируса и хитозана, а контрольные — только вирусом. Инокулированные листья промывали водой и переносили во влажные камеры. Через 4 сут после заражения листьев подсчитывали число образующихся
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.