БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 4, с. 227-230
УДК 616-092.18;616-092.9
АПОПТОЗ КЛЕТОК МИОКАРДА КРЫС ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ
© 2012 г. М. М. Азова*, М. Л. Благонравов, В. А. Фролов
Российский университет дружбы народов, 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6; *электронная почта: azovam@mail.ru Поступила в редакцию 28.06.2011 г. После доработки 25.01.2012 г.
Апоптотическую гибель клеток миокарда при генетически обусловленной артериальной гипертен-зии изучали на самцах крыс со спонтанной гипертензией (ЗИЯ) в возрасте 8, 15 и 52 недель. В качестве контроля использовали нормотензивных крыс линии ^^аг—КуЛо. В лизатах желудочков сердец колориметрическим методом определяли активность каспазы 3 и каспазы 8 по скорости расщепления синтетического субстрата. Установлено статистически значимое повышение активности обеих каспаз в миокарде левого желудочка сердца 15-недельных спонтанно гипертензивных крыс, что указывает на усиление индуцированного внешним сигналом опосредованного каспазами апо-птоза клеток левого желудочка сердца при генетически обусловленной артериальной гипертензии. В миокарде правого желудочка значимых отличий от контроля не обнаружено.
Ключевые слова: апоптоз, каспаза, миокард, артериальная гипертензия, спонтанно гипертензивные крысы.
Апоптоз, или программированная клеточная гибель, представляет собой генетически регулируемый процесс элиминации дефектных или выполнивших свое предназначение ("ненужных") клеток, присущий, как оказалось, не только многоклеточным организмам, но и простейшим [1]. Характерными признаками апоптоза являются фрагментация ДНК, конденсация и маргинация хроматина, фрагментация цитоплазмы с образованием окруженных мембраной апоптозных телец, поглощаемых впоследствии макрофагами и соседними клетками. В отличие от некроза, при апоптотической гибели клеток многоклеточного организма воспалительный процесс не развивается, и остальные клетки продолжают нормально функционировать [2].
Ключевые участники процесса программированной гибели клеток — митохондрии, про- и ан-тиапоптозные белки (каспазы, апоптоз-индуци-рующий фактор (AIF), цитохром С, эндонукле-азы, p53, белки семейства Bcl-2 и др.). Гибель клеток может индуцироваться как внешними, так и эндогенными сигналами. В первом случае апо-птоз обусловлен взаимодействием мембранных рецепторов с внеклеточными лигандами (Fas, фактор некроза опухолей (TNF)), в результате чего сначала активируется инициаторная каспаза 8, а затем эффекторная (казнящая) каспаза 3. Во втором случае казнящая каспаза активируется в ответ на высвобождение проапоптозных белков из митохондрий. Расщепление белковых субстратов и активация ДНКазы CAD (caspase-activated
DNase) эффекторными каспазами приводит в конечном итоге к фрагментации ДНК и деструкции клетки [3—6]. Однако возможен и некаспазный механизм расщепления ДНК с участием AIF и эн-донуклеазы G, перемещающихся из митохондрий к ядру [7, 8].
Для обнаружения деградации ДНК in situ применяют так называемый TUNEL-метод (terminal deoxynucleotide nick-end labeling), основанный на детекции З'-концов ДНК. Суть этого метода состоит в специфическом связывании dUTP, меченного биотином, с З'-концом разорванной цепи ДНК. Следует отметить, что этот метод не может считаться строго специфичным для апоптоза. Обнаружено, что TUNEL-позитивное окрашивание может быть ассоциировано с репарацией ДНК и некротическими процессами и, как следствие, приводить к ложноположительным результатам [2]. Разрывы ДНК также можно регистрировать электрофоретически.
В настоящее время апоптоз все чаще выявляют, оценивая активность каспаз. В большинстве случаев рассматривается каспаза 3, так как именно на ней сходятся различные пути апоптотиче-ской гибели, и ее активация указывает на индукцию апоптоза. Если же определять и активность каспазы 8, как сделано в нашей работе, то можно обнаружить не только апоптоз, но и путь его запуска, поскольку активация каспазы 8 указывает на рецепторный (внешний) механизм инициации процесса. Именно это становится основным преимуществом данного метода.
228
АЗОВА и др.
Программированная клеточная гибель является нормальным физиологическим процессом, который обеспечивает тканевый гомеостаз и играет важную роль в онтогенезе. Подавление апоптоза способно привести к развитию опухолевых и аутоиммунных заболеваний [9]. Однако и его чрезмерная активация также сопровождается развитием патологических процессов, в связи с чем особый интерес вызывает апоптоз терминально детерминированных клеток, к числу которых относятся кардиомиоциты. Несмотря на данные, указывающие на способность некоторых кардио-миоцитов к пролиферации [10], значительное усиление гибели клеток миокарда может стать одной из причин развития сердечной недостаточности [11]. Триггерами апоптотической гибели кар-диомиоцитов могут быть различные стрессовые факторы, включая гипоксию, свободные радикалы и токсины, вирусную инфекцию, острую и хроническую перегрузку [12—16].
В последние годы большое внимание уделяется изучению программированной гибели кардио-миоцитов при артериальной гипертензии (АГ) различной этиологии. АГ приводит к хронической перегрузке сердца, создавая условия, при которых индукторы апоптоза преобладают над его супрессорами, и стимулируется вступление клеток в апоптоз [17]. Усиление апоптоза кардио-миоцитов обнаружено при гипертрофии миокарда у больных эссенциальной гипертензией как при нормальной функции сердца, так и при хронической сердечной недостаточности [18, 19]. Аналогичные данные получены и в опытах на животных. Усиление интенсивности программированной гибели клеток выявлено в левом желудочке сердца спонтанно-гипертензивных крыс (8ИЯ), крыс с почечной гипертензией и с гипертензией, индуцированной ангиотензином II [20—22].
В связи с тем, что более 90% случаев АГ представлены эссенциальной гипертензией, значительный интерес представляет изучение влияния генетически обусловленной гипертонии на апо-птотическую гибель клеток миокарда. При изучении апоптоза кардиомиоцитов у больных АГ приходится сталкиваться с рядом ограничений, главное из которых — отсутствие возможности получения данных в группах сравнения. Таким образом, возникает необходимость проведения опытов на животных моделях. Наиболее близким к первичной гипертензии человека, а также удобным для содержания и изучения объектом служат крысы 8ИЯ. Несмотря на довольно многочисленные публикации, посвященные изучению программированной гибели кардиомиоцитов у крыс 8ИЯ, многое остается неизвестным, в том числе динамика процесса, механизмы его запуска и, следовательно, способы регуляции. Последнее представляется особенно важным, так как апоптоз может служить мишенью для медикаментозного воздействия с целью лечения больных или
предотвращения развития хронической сердечной недостаточности при АГ.
Цель представленной работы состояла в определении интенсивности и возможных путей инициации апоптоза клеток миокарда желудочков сердца спонтанно гипертензивных крыс в динамике развития артериальной гипертензии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на приобретенных в питомнике лабораторных животных "Пущино" 18 самцах крыс SHR в возрасте 8 (n = 8), 15 (n = 5) и 52 (n = 5) недель. В качестве контроля использовали выращенных в виварии РУДН нормотензив-ных крыс линии Wistar—Kyoto соответствующего возраста (по пять особей в группе).
Ткань желудочков сердца крыс измельчали в гомогенизаторе WiseTis серии HG-15 (Daihan Scientific, Южная Корея ) с ротором 8 мм при скорости 4500 об/мин. Для этого использовали среду выделения (20 мМ HEPES, pH 7.5, 10 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитол), к которой добавляли коктейль ингибиторов протеаз (104 мМ 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторид гидрохлорид, 0.08 мМ апротинин, 1.5 мМ пепстатин А, 2 мМ лейпептин, 4 мМ бестатин, 1.4 мМ Е-64) в соотношении 100 : 1 (все реактивы фирмы Sigma, США). Гомогенаты ткани желудочков центрифугировали в микроцентрифуге Heraeus fresco 17 (Thermo Electron LED GmbH, Германия) при 15000 g в течение 30 мин при температуре 4°С. Су-пернатанты использовали для оценки активности каспаз 3 и 8.
Активность каспазы 3 и каспазы 8 определяли колориметрическим методом по скорости расщепления синтетического субстрата с помощью наборов реактивов Caspase 3 Assay Kit, Colorimet-ric и Caspase 8 Assay Kit, Colorimetric (Sigma, США). Оптическую плотность регистрировали на планшетном иммуноферментном анализаторе Sunrise (Tecan, Швейцария) при длине волны 405 нм.
Исследования проводили на оборудовании Центра коллективного пользования (НОЦ) и кафедры общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета РУДН.
Статистические расчеты выполняли с использованием программы STATISTICA 6 (StatSoft Inc., США), для оценки статистической значимости различий применяли U-критерий Манна—Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты определения активности каспаз в миокарде левого желудочка крыс представлены в табл. 1. У 15-недельных крыс SHR активность каспазы 3 была статистически значимо выше, чем у животных контрольной группы того же возрас-
АПОПТОЗ КЛЕТОК МИОКАРДА КРЫС
229
та. У 8-недельных и годовалых крыс SHR активность каспазы 3 была такой же, как в контроле.
На протяжении последнего десятилетия активно изучают повышение интенсивности апо-птоза в миокарде крыс SHR, однако крайне мало работ, посвященных динамике этого процесса. Более того, имеющиеся немногочисленные данные весьма противоречивы. Так, согласно одним из них, интенсивность апоптоза значимо повышается начиная с 4-недельного возраста, выходит на плато к 16 неделям и сохраняется на столь же высоком уровне вплоть до 64 недель [23]. Согласно другим сведениям, интенсивность апоптоти-ческой гибели кардиомиоцитов у 30-недельных крыс SHR значимо выше, чем у 16-недельных [20]. Наиболее близки к нашим результатам данные работы [24], показывающие, что у новорожденных крыс SHR в течение первых недель жизни интенсивность апоптоза клеток миокарда ниже, чем у нормотензивных животных, затем по мере развития гипертензии она резко возрастает, а после 24
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.