ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 3, с. 273-282
БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.115:593.96
АПОПТОЗМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОСТАГЛАНДИНА Е2 В ЦЕЛОМОЦИТАХ ГОЛОТУРИИ Eupentacta fraudatrix ЗАВИСИТ ОТ АНТИОКСИДАНТНОГО ФЕРМЕНТНОГО СТАТУСА КЛЕТОК
© 2007 г. Л. С. Долматова, О. А. Заика
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАИ, 690041 Владивосток, ул. Балтийская, 43 E-mail: dolmatova@poi.dvo.ru Поступила в редакцию 17.01.2006 г.
Исследовано влияние простагландина (ПГ)Е2 на апоптоз и антиоксидантную ферментную активность в двух фракциях целомоцитов голотурии E. fraudatrix in vitro и in vivo. Показано, что ПГЕ2 (10-8 М-10-6 М) оказывал in vitro апоптозмодулирующее действие, зависящее от времени и концентрации препарата, в обеих исследованных фракциях. В опытах in vivo ПГЕ2 в концентрациях 0.1-1 мкг/г индуцировал апоптоз во фракции, обогащенной морулоподобными клетками. Фагоциты были более чувствительны к регулирующему влиянию ПГЕ2. Апоптозиндуцирующее действие ПГ на эти клетки проявлялось уже при концентрации 0.01 мкг/г, а при концентрации 10 мкг/г наблюдалось антиапоптотическое влияние. Развитие апоптоза во всех экспериментах сопровождалось дисбалансом ферментной антиоксидантной системы, прежде всего, снижением активности каталазы.
Интенсивность проводимых во всем мире исследований клеток гемолимфы и целомической жидкости морских беспозвоночных животных, выполняющих роль иммуноцитов, связана как с необходимостью понимания эволюции иммунной системы, так и с перспективами использования иммунных клеток низших животных в моделировании иммунного ответа и экологическом мониторинге.
Особого внимания заслуживают представители типа иглокожих (Echinodermata), которые, являясь относительно низкоорганизованными, в то же время относятся к вторичноротым животным и имеют общего предка с позвоночными. Большую часть объема тела иглокожих занимает полость, заполненная целомической жидкостью с находящимися в ней клетками - целомоцитами, что обуславливает простоту получения этих клеток в относительно больших количествах. Цело-моциты иглокожих представляют гетерогенную клеточную популяцию, включающую несколько типов и разновидностей клеток, из которых наиболее многочисленными являются амебоциты (или фагоциты) и морулоподобные клетки (Byrne, 1986; Canicatti et al, 1989). Последние синтезируют ряд гуморальных факторов защиты, участвуют в инкапсуляции чужеродных микроорганизмов, осуществляют синтез компонентов соединительной ткани. Фагоциты же иглокожих функционально сходны с макрофагами позвоночных, они осуществляют фагоцитоз и инкапсулирование чужеродного материала (Исаева, Коренбаум, 1989; Chia, Xing, 1996).
Одним из важных элементов функционирования иммунной системы живых организмов является апоптоз - запрограммированная гибель клеток, с помощью которой происходит удаление дифференцирующихся или функционально неполноценных клеток или клеток, представляющих потенциальную опасность (мутантные, инфицированные и т.д.) для организма (Зенков и др., 1999). Многие генетические механизмы апоптоза были определены именно на клетках беспозвоночных животных, простота организации которых облегчает исследование.
Изучение апоптоза у иглокожих, проведенное на ооцитах и ранних эмбрионах морских ежей (Voronina, Wessel, 2001), показало, что апоптоз у этих животных, как и у позвоночных, сопровождается морфологическими изменениями клеток, уплотнением и деградацией хроматина, активацией каспаз - эндопептидаз, играющих центральную роль в развитии апоптоза. Однако апоптоз и механизмы его регуляции в иммуноцитах морских беспозвоночных практически не изучены.
В иммунных клетках позвоночных животных первостепенную роль в опосредовании эффектов различных иммунорегуляторных молекул, прежде всего цитокинов, играет ПГЕ2, внося тем самым существенный вклад в величину иммунного ответа (Громыхина, Козлов, 1996). В частности, через стимуляцию синтеза аденилатциклазы и роста цАМФ (McConkey et al., 1990), он может модулировать апоптоз в клетках (Маянский и др., 1999). ПГ-подобные вещества обнаружены и у многих морских беспозвоночных (Nomura, Ogata,
1976; Мищенко и др., 1982). Среди иглокожих особенно высоким содержанием простагланди-нов, в том числе ПГЕ2, отличаются некоторые виды голотурий (Holothuroidea, Dendrochirota): Apos-tichopus japonicus, Cucumaria japonica. Однако ткани голотурии Eupentacta fraudatrix содержат гораздо меньше ПГ, чем ткани указанных выше близких ей видов голотурий (Мищенко и др., 1982). В отличие от позвоночных, у беспозвоночных животных значение ПГ в регуляции иммунитета изучено слабо. Исследования в этой области проводились преимущественно на насекомых (Miller et al., 1994), и полученные данные свидетельствовали о важном значении эйкозаноидов (ПГ и лейкотриенов) в регуляции их иммунитета. Для морских артропод была показана возможность индукции воспаления ПГЕХ (Casterlin, Reynolds, 1979), что также предполагает возможную иммунорегуляторную роль ПГ у морских беспозвоночных. Вместе с тем, работы по исследованию влияния простагландинов на иммунитет иглокожих и возможных механизмов реализации этого влияния практически отсутствуют.
У позвоночных животных установлена тесная связь между продукцией активных метаболитов кислорода (АМК) и уровнем апоптоза в иммунных клетках (Маянский и др., 1999). Высокая ок-сидантная активность фагоцитов позвоночных нуждается в строгом контроле, и поэтому клетки этих животных имеют также высокую антиокси-дантную ферментную активность. Супероксид-дисмутаза (СОД) осуществляет перевод одного из инициирующих радикалов в цепи свободноради-кального окисления - супероксидного анионради-
кала O2 в форму менее токсичной для клетки перекиси водорода, детоксикацию которой осуществляет каталаза, а глутатионредуктаза (ГР) обеспечивает сохранение пула восстановленного глутатиона, расходующегося как в неэнзиматиче-ских, так и энзиматических реакциях обезвреживания перекисей липидов (Зенков и др., 1999). Высокая активность большинства антиоксидант-ных ферментов обнаружена и в целомоцитах голотурий, в частности, голотурии E. fraudatrix (Долматова и др., 2004). В связи с этим целью данного исследования явилось изучение особенностей влияния ПГЕ2 на уровень апоптоза и активность антиоксидантных ферментов во фракциях целомоцитов голотурии E. fraudatrix in vitro и in vivo.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Голотурии E. fraudatrix (4-6 см длиной) были собраны в заливе Петра Великого осенью и зимой 2002 г. До начала экспериментов они находились в аквариуме с проточной аэрируемой морской водой в течение 4 нед.
Для проведения опытов in vitro за сутки до эксперимента с целью подавления эндогенного синтеза ПГ животным вводили индометацин (10 мкг/г). Животных разрезали и целомическую жидкость сливали в пенициллиновые флаконы с антикоагулирующим раствором (1 : 1, об./об.) следующего состава: 30 мМ этилендиаминтетра-уксусная кислота (ЭДТА), 31 г/л NaCl, 50 мМ mpuc-HCl, pH 7.6 (Chia, Xing, 1996). Целомическую жидкость 15 животных объединяли для последующего выделения клеточных фракций. Образцы жидкости наносили на ступенчатый градиент фиколла-верографина при соотношении объемов фиколла-верографина и антикоагулиру-ющего раствора 1 : 0 (1-я ступень); 1 : 0.4 (2-я ступень); 1 : 1 (3-я ступень) и 1 : 2 (4-я ступень). Центрифугировали при 300 g в течение 15 мин при 5°C. Отбирали и объединяли фракции фагоцитов, полученные в интерфазе между образцом цело-мической жидкости и 4-й ступенью и в интерфазе между 4-й и 3-й ступенями градиента. Фракцию, обогащенную морулоподобными клетками, получали в интерфазе между 2-й и 3-й ступенями. Полученные клетки отмывали фосфатно-соле-вым буфером (pH 7.4) с добавлением NaCl (3.6 г/л) (ФСБН) и ресуспендировали в среде 199, дополнительно содержащей на 1 л: 16.41 г NaCl, 0.264 г KCl, 0.87 г CaCl2, 4.98 г MgCl2 ■ 6H2O, 3.87 г MgSO4 ■ 7H2O, 22.74 г глицина, 0.1 г глюкозы, 2.5 г бычьего сывороточного альбумина, 50 мг окса-циллина натрия (Долматова и др., 2002).
Жизнеспособность клеток в полученных фракциях определяли по исключению трипано-вого синего (Phillips, 1973). Подсчет клеток производили в камере Горяева.
Клеточные суспензии объединенной фракции фагоцитов или фракции, обогащенной морулоподобными клетками (0.5-1 млн. кл./лунку), инкубировали в круглодонных планшетах при 20°С с добавлением ФСБН (контроль) или индометаци-на (10-6 М) (контроль действия индометацина), или с добавлением одновременно индометацина и ПГЕ2 в концентрациях 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М. Инкубацию проводили в двух параллельных сериях. Отбор проб производили через 0, 48 и 72 ч инкубации (для определения ферментативной активности еще и через 24 ч).
В опытах in vivo после предварительного 3-су-точного введения индометацина в дозе 10 мкг/г ежесуточно животные получали однократные инъекции ФСБН (контроль) или ПГЕ2 в концентрациях 0.01, 0.1, 1.0, 10.0 мкг/г. Целомическую жидкость получали через 1 ч после инъекции. Было использовано 18 животных, на 1 группу брали по 3 экземпляра, целомоциты которых объединяли. Фракции клеток получали, как описано выше.
По окончании всех опытов до определения активности ферментов часть суспензии клеток замораживали в жидком азоте и хранили при -18°C. Для анализа ДНК другую часть суспензии клеток центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин при 5°C, осадок клеток замораживали и хранили до выделения ДНК.
Выделение ДНК проводили по модифицированному методу Праманик с соавт. (Pramanick et al., 1976). Оно включало следующие этапы: разрушение клеток лизирующим буфером (0.05 M mpuc-HCl (pH 7.6), 0.01 M ЭДТА, 1%-ный додецилсульфат натрия); депротеинизацию 8 М гуанидингидрохлоридом; экстракцию хлороформом с изопропиловым спиртом (1 : 24, об./об.) и осаждение ДНК из водного слоя двойным объемом этанола (Dolmatov et al, 2004). Детекцию фрагментации ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле с использованием mpuc-боратного буфера (рН 8.3). По окончании электрофореза гель окрашивали бромистым этидием. ДНК и ее фрагменты идентифицировали при облучении ультрафиолетовым светом (длина волны 240 нм).
Перед опреде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.