научная статья по теме АПОПТОЗНЫЙ ХАРАКТЕР ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ МАЛЫМИ ДОЗАМИ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ Биология

Текст научной статьи на тему «АПОПТОЗНЫЙ ХАРАКТЕР ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ МАЛЫМИ ДОЗАМИ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ»

БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 102-108

= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =

УДК 577.3

АПОПТОЗНЫЙ ХАРАКТЕР ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ, ИНДУЦИР ОВАННЫЙ МАЛЫМИ ДОЗАМИ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ

© 2015 г. В.Н. Крылов, А.В. Дерюгина, С.Н. Плескова, В.А. Калинин

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 603600, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23 E-mail: kfg@bio.unn.ru Поступила в p едакцию 17.07.14 г. После доработки 04.09.14 г.

Установлено, что воздействие малыми дозами ионизирующей радиации (0,04; 0,08; 0,16; 0,25 и 0,33 мГр) на эритроциты крыс приводит к нелинейному изменению процессов перекисного окисления липидов в мембране эритроцитов, их электрофоретической подвижности, осмотической резистентности. В интервале доз ионизирующего облучения от 0,08 до 0,16 мГр, вероятно, запускается программа апоптоза, определяющая временное замедление процесса гемолиза и стабилизацию эритроцитов, что подтверждается морфологическими изменениями эритроцитов.

Ключевые слова: апоптоз, гемолиз, ионизирующая радиация, эритроциты.

Исследование влияния малых доз ионизирующей радиации на структур но-функциональное со стояние мембран клеток является актуальным для понимания молекуляр ных механизмов радиационного повреждения и возникающей устойчивости ор ганизма к действию данного фактора [1]. Однако большинство работ в этом направлении выполнено с применением хронического или длительного облучения, когда регистрируются интегральные и отдаленные последствия р адиации, что затр удняет выявление переходных механизмов деструктивных и защитных процессов. Более информативные механизмы этих процессов могут быть выявлены при кратковременном облучении малыми дозами ионизирующей радиации. По существующим пр едставлениям, ионизир ующая радиация в малых дозах запускает в клетках каскад р е-акций, приводящих к их выживанию или гибели. Вместе с тем гибель клеток сегодня рассматривается не только как некроз или ауто-фагия [2], но и как апоптоз - запрограммиро-ванная гибель и удаление нежелательной или поврежденной клетки [1-3]. Логично предполо -жить, что этот процесс может происходить и при радиационном поражении клеток. Основ-

Сокращения: НИР - низкоинтенсивная ионизирующая радиация, ЭФПЭ - электрофоретическая подвижность эритроцитов, МДА - малоновый диальдегид, АСМ - атом-но-силовая микроскопия, ПОЛ - перекисное окисление липидов.

ная роль в запуске и реализации программируемой смерти - апоптоза - принадлежит клеточной мембране, механизм р азрушения которой в этом процессе остается пока неясным [4,5]. Эритроциты in vitro являются удобным объектом для выяснения мембранных механизмов повреждающего действия низкоинтенсивной ионизирующей радиации (НИР), не опо-ср едованных метаболизмом. В эритроцитах также осуществляются два пути гибели - апоптоз и гемолиз, которыми в норме заканчивается их жизненный цикл [6,7]. Однако с учетом того факта, что эр итроциты характеризуются отсутствием ядра и митохондрий, они лишены и некоторых характерных особенностей апоптоза ядросодержащих клеток, таких как деполяризация митохондрий и конденсация хроматина ядра. Вместе с тем у эритроцитов четко визуализируются другие признаки апоптоза, такие как умеьшение объема клеток, везикуляция (образование апоптозных телец) и перераспределение липидов мембраны, которое приводит к выходу фосфатидилсерина на поверхность. Для обозначения апоптоза эритроцитов в 2005 г. введен в научный оборот термин «эриптоз» [8]. Основные воздействия, пр иводящие к реализа -ции механизма эриптоза: окислительный стресс, осмотический шок, энергетическое истощение клеток [9]. Они же могут лежать в основе апоп-тоз-ассоциированных нарушений, возникающих при ряде заболеваний, а также возникать при

воздействии на клетку разных лекарственных веществ и ксенобиотиков [10]. Вместе с тем в литературе отсутствуют данные об аналогичных изменениях эритр оцитов при радиационном облучении. Апоптоз эритроцитов обычно рассматривается как механизм, тормозящий гемолиз и приводящий к временной «стабилизации» клеток [11]. Предполагается, что в начальный период апоптоза (предапоптозные эр итроциты) существуют переходные (обратимые) процессы, определяющие защитный механизм, снижающий содержание осмолитов внутри клетки и, тем самым, стабилизирующий ее гомеостаз [12,13]. И сследование механизмов такой защиты будет способствовать развитию методов ее повышения при радиационном поражении организма.

Цель работы - изучить апоптотозный характер изменений эритроцитов крыс в динамике однократного кратковременного (40 мин) облучения малыми дозами низкоинтенсивной ра -диации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлась цельная кровь крыс, стабилизированная антикоагулянтом - 5%-м цитратом натрия. Облучение крови проводили в чашке Петри (диаметр 3 см) при толщине слоя жидкости 2 мм, помещая на расстоянии 1 см от поверхности стандартный в-источник ионизирующей радиации 90Бг-90У с активностью 9104 Бк и р асчетной мощностью дозы 0,5 мГр/ч. К р овь анализировали через 5, 10, 20, 30 и 40 мин после начала облучения (соответствующие расчетные дозы при этом со -ставляли 0,04; 0,08; 0,16; 0,25 и 0,33 мГр). На каждом этапе облучения из общего объема отбирали часть крови (0,5 мл) и проводили подсчет количества эритроцитов, вышедшего гемоглобина, электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ), концентрации в них малонового диальдегида (МДА), морфологии клеток. Контролем служили образцы необлученной крови, анализируемые по тем же параметрам. Используемые в опытах эритроциты трижды отмывали 0,85%-м раствором хлор истого натрия, центрифугируя 10 мин при 1500 об/мин.

Анализ числа эритроцитов, ресуспензиро-ванных в 3% КаС1, оценивали фотометрически при длине волны 650 нм. Оптическое поглощение супернатанта после соответствующего разведения 0,85% КаС1, характеризующего количество вышедшего гемоглобина, определяли спектрофотометрически при длине волны X = 540 нм [14]. Измерение ЭФПЭ производили методом микроэлектр офореза [15], р егистрируя

время прохождения эритроцитами расстояния 10 мкм в трис-НCl буфере с рН 7,4 при силе тока 10 мА. Интенсивность перекисного окисления липидов определяли по содержанию малонового диальдегида в эр итроцитах. Концентрацию МДА определяли по реакции с тио-барбитуровой кислотой [11]. Плотность окраски триметинового комплекса регистрировали при 530 нм. Для расчета концентрации МДА использовали коэффициент молярной экстинции E = 1,5610-5 М-1см-1.

Морфологию эритроцитов исследовали методом атомно-силовой микроскопии (А СМ) [16]. Фиксацию клеток проводили 2%-м глюта-ровым альдегидом ср азу после самопроизвольной адгезии клеток. Исследования поверхности клеток проводили на установке SOLVER BIO™ (NT-MDT, Зеленогр ад), включающей в себя оптический инвертированный микр оскоп, на котором устанавливали АСМ-головку. Исследование топографии эритроцитов производили в полуконтактном режиме кантилеверами DNP (Vee^, С ША). Для сканирования использовали зонды А и С с жесткостью 0,58 и 0,32 Н/м соответственно, радиусом закругления на вершине - 50 нм, углом при вершине 70°. Анализ изображений проводили с использованием про -граммного обеспечения SPMLab Analysis Only (ТорошеМх, США).

После доказательства принадлежности экспериментальных данных к нормальному распределению с использованием критерия Шапи-ро-Уилка определяли значения средних арифметических и стандартных отклонений. Для сравнения двух подгрупп использовали ¿-критерий Стьюдента [17]. Для статистической обработки полученных результатов использовали табличный редакто р Mkrosoft Ехсе1 2007 и про -грамму Origin 8,0 Server.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 показана динамика изменения оптической плотности супернатанта крови, облученной разными дозами НИР. Как видно, кривая, демонстрирующая выход гемоглобина (опыт), р асположена выше контрольного ур ов-ня (необлученная кровь) и значительно ниже его в присутствии сапонина (100% гемолиз). При этом при облучении в дозе 0,04 мГр выход гемоглобина усиливается в 1,4 раза относительно контроля, а в интервале доз 0,08-0,16 мГр количество эвакуированного гемоглобина снижается. С увеличением дозы р адиации до 0,33 мГр скорость гемолиза вновь увеличивается (в 1,9 раза). Таким обр азом, реакция эритроцитов на НИР не является монотонной, по

е о.5-

о

а о.4-

о и

§ 0.3-

И

¡0.2- ^ О

Ег1

Е о.1 -

н И

О |-,-,-,-,-,

0.04 0.08 0.16 0.25 0.33

Доза НИР, мГр

Рис. 1. Изменения оптической плотности надоса-дочной жидкости после воздействия НИР на эр ит-роциты: * - р < 0,05 по отношению к значению до воздействия (контроль).

всей вер оятности существует некотор ый «кор и-дор воздействия», в котором компенсаторные механизмы клеток реализуются максимально. В данном случае он соответствовал расчетным дозам 0,08-0,16 мГр. В этом диапазоне пр оис-ходит не только гемолиз клеток (как пр и более низкой дозе в 0,04 мГр), но и сохранение целостности клеточных мембр ан. По всей вер о -ятности, именно в этом «коридоре» максимально реализуют ся все компенсатор но-гомеостати-ческие (в том числе антиоксидантные) пр оцес-сы. Можно пр едположить, что пр и таких воздействиях энергетические, ферментативные и антиоксидантные системы и стощаются настолько, что эритр оцит запускает механизм запр о -гр аммир ованной гибели клетки. О вер но сти такой гипотезы свидетельствуют нижеприведенные р езультаты.

В таблице пр иведены р езультаты фотометр ического анализа количества эр итр оцитов ин-тактной и облученной крови. Они свидетельствуют о пр огр ессир ующем снижении числа живых клеток с ростом дозы НИР, динамика котор ой также не является монотонной. Наибольшая скор о сть гемолиза (пр оцент убыли

эритроцитов) наблюдается после воздействия начальной (на 9,1% относительно контр оля) и конечной (на 15,7%) доз облучения.

Из пр иведенных данных следует, что р а -диоиндуцируемый гемолиз, в отличие от сапонинового, является менее массир ованным и, по-видимому, определяется целостными клетками с меньшим числом пор и р азмер ом, до статочным для выхода гемоглобина. Вер оятно, потер я гемоглобина в этом случае осуществляется через локальные дефектины (разрыв

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»