БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 102-108
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
АПОПТОЗНЫЙ ХАРАКТЕР ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ, ИНДУЦИР ОВАННЫЙ МАЛЫМИ ДОЗАМИ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
© 2015 г. В.Н. Крылов, А.В. Дерюгина, С.Н. Плескова, В.А. Калинин
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 603600, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23 E-mail: kfg@bio.unn.ru Поступила в p едакцию 17.07.14 г. После доработки 04.09.14 г.
Установлено, что воздействие малыми дозами ионизирующей радиации (0,04; 0,08; 0,16; 0,25 и 0,33 мГр) на эритроциты крыс приводит к нелинейному изменению процессов перекисного окисления липидов в мембране эритроцитов, их электрофоретической подвижности, осмотической резистентности. В интервале доз ионизирующего облучения от 0,08 до 0,16 мГр, вероятно, запускается программа апоптоза, определяющая временное замедление процесса гемолиза и стабилизацию эритроцитов, что подтверждается морфологическими изменениями эритроцитов.
Ключевые слова: апоптоз, гемолиз, ионизирующая радиация, эритроциты.
Исследование влияния малых доз ионизирующей радиации на структур но-функциональное со стояние мембран клеток является актуальным для понимания молекуляр ных механизмов радиационного повреждения и возникающей устойчивости ор ганизма к действию данного фактора [1]. Однако большинство работ в этом направлении выполнено с применением хронического или длительного облучения, когда регистрируются интегральные и отдаленные последствия р адиации, что затр удняет выявление переходных механизмов деструктивных и защитных процессов. Более информативные механизмы этих процессов могут быть выявлены при кратковременном облучении малыми дозами ионизирующей радиации. По существующим пр едставлениям, ионизир ующая радиация в малых дозах запускает в клетках каскад р е-акций, приводящих к их выживанию или гибели. Вместе с тем гибель клеток сегодня рассматривается не только как некроз или ауто-фагия [2], но и как апоптоз - запрограммиро-ванная гибель и удаление нежелательной или поврежденной клетки [1-3]. Логично предполо -жить, что этот процесс может происходить и при радиационном поражении клеток. Основ-
Сокращения: НИР - низкоинтенсивная ионизирующая радиация, ЭФПЭ - электрофоретическая подвижность эритроцитов, МДА - малоновый диальдегид, АСМ - атом-но-силовая микроскопия, ПОЛ - перекисное окисление липидов.
ная роль в запуске и реализации программируемой смерти - апоптоза - принадлежит клеточной мембране, механизм р азрушения которой в этом процессе остается пока неясным [4,5]. Эритроциты in vitro являются удобным объектом для выяснения мембранных механизмов повреждающего действия низкоинтенсивной ионизирующей радиации (НИР), не опо-ср едованных метаболизмом. В эритроцитах также осуществляются два пути гибели - апоптоз и гемолиз, которыми в норме заканчивается их жизненный цикл [6,7]. Однако с учетом того факта, что эр итроциты характеризуются отсутствием ядра и митохондрий, они лишены и некоторых характерных особенностей апоптоза ядросодержащих клеток, таких как деполяризация митохондрий и конденсация хроматина ядра. Вместе с тем у эритроцитов четко визуализируются другие признаки апоптоза, такие как умеьшение объема клеток, везикуляция (образование апоптозных телец) и перераспределение липидов мембраны, которое приводит к выходу фосфатидилсерина на поверхность. Для обозначения апоптоза эритроцитов в 2005 г. введен в научный оборот термин «эриптоз» [8]. Основные воздействия, пр иводящие к реализа -ции механизма эриптоза: окислительный стресс, осмотический шок, энергетическое истощение клеток [9]. Они же могут лежать в основе апоп-тоз-ассоциированных нарушений, возникающих при ряде заболеваний, а также возникать при
воздействии на клетку разных лекарственных веществ и ксенобиотиков [10]. Вместе с тем в литературе отсутствуют данные об аналогичных изменениях эритр оцитов при радиационном облучении. Апоптоз эритроцитов обычно рассматривается как механизм, тормозящий гемолиз и приводящий к временной «стабилизации» клеток [11]. Предполагается, что в начальный период апоптоза (предапоптозные эр итроциты) существуют переходные (обратимые) процессы, определяющие защитный механизм, снижающий содержание осмолитов внутри клетки и, тем самым, стабилизирующий ее гомеостаз [12,13]. И сследование механизмов такой защиты будет способствовать развитию методов ее повышения при радиационном поражении организма.
Цель работы - изучить апоптотозный характер изменений эритроцитов крыс в динамике однократного кратковременного (40 мин) облучения малыми дозами низкоинтенсивной ра -диации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлась цельная кровь крыс, стабилизированная антикоагулянтом - 5%-м цитратом натрия. Облучение крови проводили в чашке Петри (диаметр 3 см) при толщине слоя жидкости 2 мм, помещая на расстоянии 1 см от поверхности стандартный в-источник ионизирующей радиации 90Бг-90У с активностью 9104 Бк и р асчетной мощностью дозы 0,5 мГр/ч. К р овь анализировали через 5, 10, 20, 30 и 40 мин после начала облучения (соответствующие расчетные дозы при этом со -ставляли 0,04; 0,08; 0,16; 0,25 и 0,33 мГр). На каждом этапе облучения из общего объема отбирали часть крови (0,5 мл) и проводили подсчет количества эритроцитов, вышедшего гемоглобина, электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ), концентрации в них малонового диальдегида (МДА), морфологии клеток. Контролем служили образцы необлученной крови, анализируемые по тем же параметрам. Используемые в опытах эритроциты трижды отмывали 0,85%-м раствором хлор истого натрия, центрифугируя 10 мин при 1500 об/мин.
Анализ числа эритроцитов, ресуспензиро-ванных в 3% КаС1, оценивали фотометрически при длине волны 650 нм. Оптическое поглощение супернатанта после соответствующего разведения 0,85% КаС1, характеризующего количество вышедшего гемоглобина, определяли спектрофотометрически при длине волны X = 540 нм [14]. Измерение ЭФПЭ производили методом микроэлектр офореза [15], р егистрируя
время прохождения эритроцитами расстояния 10 мкм в трис-НCl буфере с рН 7,4 при силе тока 10 мА. Интенсивность перекисного окисления липидов определяли по содержанию малонового диальдегида в эр итроцитах. Концентрацию МДА определяли по реакции с тио-барбитуровой кислотой [11]. Плотность окраски триметинового комплекса регистрировали при 530 нм. Для расчета концентрации МДА использовали коэффициент молярной экстинции E = 1,5610-5 М-1см-1.
Морфологию эритроцитов исследовали методом атомно-силовой микроскопии (А СМ) [16]. Фиксацию клеток проводили 2%-м глюта-ровым альдегидом ср азу после самопроизвольной адгезии клеток. Исследования поверхности клеток проводили на установке SOLVER BIO™ (NT-MDT, Зеленогр ад), включающей в себя оптический инвертированный микр оскоп, на котором устанавливали АСМ-головку. Исследование топографии эритроцитов производили в полуконтактном режиме кантилеверами DNP (Vee^, С ША). Для сканирования использовали зонды А и С с жесткостью 0,58 и 0,32 Н/м соответственно, радиусом закругления на вершине - 50 нм, углом при вершине 70°. Анализ изображений проводили с использованием про -граммного обеспечения SPMLab Analysis Only (ТорошеМх, США).
После доказательства принадлежности экспериментальных данных к нормальному распределению с использованием критерия Шапи-ро-Уилка определяли значения средних арифметических и стандартных отклонений. Для сравнения двух подгрупп использовали ¿-критерий Стьюдента [17]. Для статистической обработки полученных результатов использовали табличный редакто р Mkrosoft Ехсе1 2007 и про -грамму Origin 8,0 Server.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показана динамика изменения оптической плотности супернатанта крови, облученной разными дозами НИР. Как видно, кривая, демонстрирующая выход гемоглобина (опыт), р асположена выше контрольного ур ов-ня (необлученная кровь) и значительно ниже его в присутствии сапонина (100% гемолиз). При этом при облучении в дозе 0,04 мГр выход гемоглобина усиливается в 1,4 раза относительно контроля, а в интервале доз 0,08-0,16 мГр количество эвакуированного гемоглобина снижается. С увеличением дозы р адиации до 0,33 мГр скорость гемолиза вновь увеличивается (в 1,9 раза). Таким обр азом, реакция эритроцитов на НИР не является монотонной, по
е о.5-
о
а о.4-
о и
§ 0.3-
И
¡0.2- ^ О
Ег1
Е о.1 -
н И
О |-,-,-,-,-,
0.04 0.08 0.16 0.25 0.33
Доза НИР, мГр
Рис. 1. Изменения оптической плотности надоса-дочной жидкости после воздействия НИР на эр ит-роциты: * - р < 0,05 по отношению к значению до воздействия (контроль).
всей вер оятности существует некотор ый «кор и-дор воздействия», в котором компенсаторные механизмы клеток реализуются максимально. В данном случае он соответствовал расчетным дозам 0,08-0,16 мГр. В этом диапазоне пр оис-ходит не только гемолиз клеток (как пр и более низкой дозе в 0,04 мГр), но и сохранение целостности клеточных мембр ан. По всей вер о -ятности, именно в этом «коридоре» максимально реализуют ся все компенсатор но-гомеостати-ческие (в том числе антиоксидантные) пр оцес-сы. Можно пр едположить, что пр и таких воздействиях энергетические, ферментативные и антиоксидантные системы и стощаются настолько, что эритр оцит запускает механизм запр о -гр аммир ованной гибели клетки. О вер но сти такой гипотезы свидетельствуют нижеприведенные р езультаты.
В таблице пр иведены р езультаты фотометр ического анализа количества эр итр оцитов ин-тактной и облученной крови. Они свидетельствуют о пр огр ессир ующем снижении числа живых клеток с ростом дозы НИР, динамика котор ой также не является монотонной. Наибольшая скор о сть гемолиза (пр оцент убыли
эритроцитов) наблюдается после воздействия начальной (на 9,1% относительно контр оля) и конечной (на 15,7%) доз облучения.
Из пр иведенных данных следует, что р а -диоиндуцируемый гемолиз, в отличие от сапонинового, является менее массир ованным и, по-видимому, определяется целостными клетками с меньшим числом пор и р азмер ом, до статочным для выхода гемоглобина. Вер оятно, потер я гемоглобина в этом случае осуществляется через локальные дефектины (разрыв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.