ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2011, № 5, с. 524-531
= БИОХИМИЯ
УДК 577.121;611-018.5
АРГИНАЗА, НИТРАТЫ И НИТРИТЫ В ПЛАЗМЕ И ЭРИТРОЦИТАХ ПРИ ГИПЕРТОНИИ И ТЕРАПИИ ЛИЗИНОПРИЛОМ И СИМВАСТАТИНОМ
© 2011 г. Ю. Г. Каминский*, А. В. Сусликов**, Л. А. Тихонова*, ***, М. Х. Галимова*, Г. Л. Ермаков*, В. Д. Цветков*, Е. А. Косенко*, ***
* Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино, Институтская ул., 3 ** Больница Пущинского научного центра РАН, 142290 Пущино, Институтская ул., 1 *** Пущинский государственный университет, 142290Пущино, просп. Науки, 3
E-mail: kaminsky@iteb.ru Поступила в редакцию 10.08.2010 г.
У пациентов с артериальной гипертонией и атеросклерозом активность аргиназы в эритроцитах выше, чем у здоровых лиц. Прием лизиноприла или комбинации лизиноприла с симвастатином в течение 3—6 мес. вызывали снижение активности аргиназы до контрольного уровня. Монотерапия и комбинированная терапия приводили к увеличению содержания NO2, NO3 и суммарного содержания NO2 + NO3 в плазме пациентов. В эритроцитах содержание NO- + NO3 снижалось при гипертонии, но полностью восстанавливалось после терапии лизиноприлом или комбинированной терапии. Таким образом, лизиноприл и лизиноприл с симвастатином оказывают явно выраженное и одинаковое нормализующее влияние на активность аргиназы в эритроцитах человека, повышенную при гипертонии, и на активность эндотелиальной NO-синтазы, пониженную при гипертонии.
Аргиназа (КФ 3.5.3.1) представляет собой ци-топлазматический фермент, катализирующий гидролиз L-аргинина до орнитина и мочевины и экспрессируемый, в основном, в гепатоцитах (Morris S., 2007). У человека и высших приматов аргиназа имеется в эритроцитах (Berüter et al., 1978; Kim et al., 2002).
Субстрат аргиназы L-аргинин является также субстратом для другого фермента — нитроксид (МО)-синтазы (КФ 1.14.13.39). Существуют три изоформы NO-синтазы: нейрональная, эндоте-лиальная и индуцируемая. Индуцируемая изо-форма NO-синтазы катализирует образование NO во всех тканях, в том числе в клетках крови (Charles et al., 1993; Kleinbongard et al., 2006). В эритроцитах экспрессируется эндотелиальная изоформа NO-синтазы, которая стабилизирует мембрану и регулирует ее способность к деформации (Kleinbongard et al., 2006), т.е. к проникновению эритроцитов в капилляры. NO, синтезируемый эндотелиальной изоформой NO-синтазы, регулирует тонус кровеносных сосудов: это мощный сосудорасширяющий агент.
При недостатке NO активируются тромбоциты и свертывание крови (Moneada, Higgs, 1993). Молекулярные механизмы, приводящие к недостатку NO в эндотелии, в настоящее время неясны, но предполагается, что в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов аргиназа реци-
прокно регулирует продукцию NO в конкуренции за аргинин. Неизвестно, изменяется ли активность аргиназы и имеется ли взаимосвязь между активностью аргиназы и недостатком NO в эритроцитах и плазме крови больных с сердечнососудистыми заболеваниями.
Как очень нестабильный свободный радикал, NO в циркулирующей крови быстро окисляется
до нитрита (N O-) и нитрата (N O-). Клинически доступными показателями активности эндотели-альной NO-синтазы и косвенной мерой уровня
NO служат концентрации N O2 и N O3 в крови (Lauer et al., 2001; Kleinbongard et al, 2003), а еще проще определять в клинике суммарную концентрацию NO- + NO- (СНН). Однако о превращении NO в эти метаболиты при гипертонии и после антигипертензивной терапии известно немного. При сердечно-сосудистых заболеваниях, сопровождающихся гиперхолестеринемией, пациентам назначаются, как правило, статины — препараты, понижающие уровень холестерина в крови (Kaminsky, Kosenko, 2010). Многочисленные клинические исследования показали, что статины оказывают вазопротекторное и кардио-протекторное действие (Rosenson, 2001; Tsiara et al., 2003; Mason et al., 2004), в дополнение к их холестерин-понижающему действию. Статины
восстанавливают нормальную активность NO-син-тазы в эндотелии (Feron et al., 2001), которая, как и скорость синтеза NO, снижается при гиперхо-лестеринемии (Mason et al., 2004). Положительный эффект статинов может проявляться и через регуляцию активности аргиназы, которая способна влиять на транспорт аргинина в клетки (Durante, 2001; Kitiyakara et al., 2001).
Другими антигипертоническими препаратами, широко применяемыми в медицине, являются ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) (Mason, Cockcroft, 2006).
В доступной литературе отсутствуют фундаментальные исследования, посвященные влиянию статинов и ингибиторов АПФ на активность аргиназы и обмен NO в эритроцитах и плазме пациентов при гипертонии. Результаты таких исследований могли бы стать неотъемлемой частью медицинской науки. Целью нашего исследования было выяснить влияние ингибитора АПФ ли-зиноприла и ингибитора 3-гидрокси-3-метилглу-тарил-СоА-редуктазы симвастатина на активность аргиназы, концентрации NO- и NO- в плазме крови и эритроцитах пациентов с гипертонией и атеросклерозом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании использовали часть крови пациентов в возрасте 44—72 лет (средний возраст 58 лет), взятой в клинической лаборатории для рутинного анализа. В диагнозе у пациентов имелись артериальная гипертония I—II степени тяжести по классификации Всероссийского научного общества кардиологов ВН0К-2004 (систолическое давление крови 149—167 мм рт. ст., диастоли-ческое давление 87—100 мм рт. ст.) и атеросклероз периферических артерий при отсутствии ишеми-ческой болезни сердца и повышенных концентраций общего холестерина, холестерина липо-протеидов низкой плотности, триглицеридов и креатинина в плазме крови.
Пациентам одной группы (14 человек: 8 мужчин, 6 женщин) назначали терапию лизинопри-лом в виде таблеток Диротон (Гедеон Рихтер, Венгрия) в ежесуточной дозе 10—20 мг амбулаторно в течение 6 мес., пациентам второй группы (15 человек: 8 мужчин, 7 женщин) — терапию теми же дозами лизиноприла вместе с фиксированной дозой симвастатина в виде таблеток Симвастола (Гедеон Рихтер) по 20 мг в сутки.
Венозную кровь отбирали натощак в 8—9 ч в специальные пробирки, содержащие цитрат натрия в качестве антикоагулянта, в сутки, предшествующие началу исследования (группа "до лечения"), затем после 3 и 6 мес. ежесуточного приема препаратов. Таким образом, пациенты служили самоконтролем при оценке действия двух типов
терапии: одни и те же лица участвовали в трех группах, до лечения, после 3 мес. и после 6 мес. терапии.
Исследование проводили на крови тех же пациентов, что и ранее при изучении влияния лизи-ноприла и симвастатина на гликолитические и антиокислительные ферменты в эритроцитах (Каш^ку г1 а1., 2010).
Отдельная группа из 10 добровольцев, не страдающих гипертонией и атеросклерозом, служила дополнительным контролем для сравнения с нелечеными гипертониками (группа "контроль").
Каждый препарат эритроцитов готовили методом, описанным ранее (Каш^ку г1 а1., 2010). Кровь центрифугировали 10 мин при 1000 Осадок с клетками промывали дважды в охлажденной среде, содержащей 10 мМ КН2Р04, рН 7.5; 3.5 мМ КС1, 1.5 мМ М%С12, 145 мМ ШС1 и 6 мМ глюкозу, центрифугированием при 1000 % в течение 10 мин и суспендировали в этой же среде в соотношении 1 : 5. Эритроциты хранили при 4°С не более 5 ч.
Для активации аргиназы 0.1 мл размороженной суспензии эритроцитов смешивали с 0.1 мл 100 мМ глицил-глицинового буфера (рН 8.5), содержащего 20 мМ МпС12, и инкубировали 10 мин при 55°С. Аргиназную реакцию запускали добавлением 25 мМ аргинина. Гидролиз аргинина проводили при 37°С в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 15%-ной НС104, и после центрифугирования (10000 5 мин, 4°С) супернатант нейтрализовали сухим КНСО3 и затем 30%-ным КОН до рН 7. Осадок перхлората калия удаляли повторным центрифугированием. Концентрацию мочевины в супернатанте определяли по концентрации аммиака, образуемого при гидролизе мочевины уреазой, спектрофотомет-рическим ферментативным методом ^^шапп, Бег§шеуег, 1974). Контрольную пробу на эндогенное содержание мочевины в образце готовили по вышеуказанному способу, но НС104 добавляли к суспензии эритроцитов сразу после их размораживания. Активность аргиназы выражали в мкмоль мочевины/мин на 1 мл эритроцитов.
Активность аргиназы в плазме определяли аналогично и выражали в мкмоль мочевины/мин на 1 л плазмы.
Концентрации N О- и N О- определяли методом, описанным в работах (К1етЪоп§агё г1 а1., 2002; Giustaгini а1, 2008), с использованием Грайес-реагента (водный раствор 1%-ного сульфаниламида, 6%-ной Н3РО4 и 0.1%-ного ^наф-тилэтилендиамина) и некоторых модификаций. Плазму получали центрифугированием крови при 10000 % в течение 1 мин при 4°С и хранили
при -20°С. Для определения концентрации N О2
526
КАМИНСКИЙ и др.
10.0
7.5
л
ч о
х
св Н
и
Я
о
5.0
2.5
(а)
и р
m rn
а
rn
а
Я
и
i-ч %
10.0
7.5
5.0
2.5
(б)
0
Контроль До лечения 3 мес. 6 мес.
Активность аргиназы в эритроцитах контрольных лиц и пациентов, принимавших лизиноприл (а) или лизиноприл с симвастатином (б) в течение 3 и 6 мес. *р < 0.05 при сравнении с группой "контроль"; **р < < 0.002, ***р < 0.001 при сравнении с группой "до лечения".
плазму разводили дистиллированной водой в 2—4 раза и депротеинизировали охлажденной смесью 0.6 N НСЮ4/80%-ный этанол. После центрифугирования при 10000 g в течение 5 мин при 4°С су-пернатант нейтрализовали сухим КНСО3 и 30%-ным КОН до рН 7—7.5 и повторно центрифугировали. Полученный супернатант смешивали в соотношении 1 : 1 с Грайес-реагентом, инкубировали в течение 30 мин в темноте и затем определяли абсорбцию при 540 нм. Контрольную пробу готовили так же, но к ней добавляли Грайес-реагент, не содержащий N-нафтилэтилендиамина. Концентрацию N O- определяли по калибровочной кривой для NaNO2 (0-100 мкМ).
Концентрацию N O3 измеряли после ферментативного превращения N O- плазмы в N O- под действием нитратредуктазы, как описано в работе Шмидт с соавт. (Schmidt et al, 1992). Разведенную
плазму инкубировали в течение 30 мин при 25°С с нитратредуктазой (0.02 ед. в общем объеме 0.1 мл) и 80 мкМ восстановленным никотинамидаде-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.