БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 907-912
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 538.9: 577.352.332/.335: 577.175.5: 577.31
Агр2/3-КОМПЛЕКС УЧАСТВУЕТ В ДЕЙСТВИИ ГЛУТОКСИМА И МОЛИКСАНА НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОНЦЕНТРАЦИЮ Са2+ В МАКР ОФАГАХ
© 2014 г. Л.С. Миленина, З.И. Крутецкая, А.А. Наумова, Н.И. Крутецкая,
С.Н. Бутов, В.Г. Антонов
Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9
E-mail: соцу@таИ.ги Поступила в p едакцию 09.06.14 г.
Исследовано участие Лгр2/3-комплекса, вызывающего ветвление актиновых филаментов, в действии препаратов глутоксим и моликсан на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах. С использованием флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM впервые показано, что ингибитор Лгр2/3-комплекса - соединение СК-0944666 - практически полностью предотвращает увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, индуцируемое глутоксимом или моликсаном в макрофагах. Полученные данные свидетельствуют об участии Лгр2/3-комплекса в действии глутоксима и моликсана на процессы Са2+-сигнализации в макрофагах.
Ключевые слова: Са2+-сигнализация, глутоксим, моликсан, Агр2/3-комплекс, актиновые филаменты.
В настоящее время разработано и введено в клиническую практику значительное число дисульфидсодержащих препаратов, изменяющих редокс-состояние и оказывающих физиологически значимый эффект на клетки. Так, синтетический аналог окисленного глутатиона (вББв) фармакологический препарат глутоксим® (динатриевая соль вББв с нано добавкой платины, «ФАРМА ВАМ», Москва) используется как иммуномодулятор и гемостимулятор в комплексной терапии бактериальных и вирусных заболеваний, псориаза, лучевой и химиотерапии в онкологии [1]. Д ругой препа рат -моликсан («ФАРМА ВАМ», Москва), комплекс глутоксима и нуклеозида инозина, имеет про -тивовирусный, иммуномодулирующий и гепа-топротекторный эффекты; применяется в тера -пии острого и вирусного гепатита В и С, микст-гепатита и цирроза печени [1]. Глутоксим и моликсан относятся к группе лекарственных средств тиопоэтинов, влияющих на процессы редок с-р егуляции в клетках. Однако механизмы клеточного и молекулярного действия этих препаратов далеки от полного понимания.
Ранее нами было впервые обнаружено, что глутоксим и моликсан увеличивают внутриклеточную концентр ацию С а 2+ ([Са2+];), вызывая мобилизацию Са2+ из тапсигаргин-чувствитель-
Сокращения: GSSG - окисленный глутатион, [Ca2+] -внутриклеточная концентрация Ca2+, ФЭУ - фотоэлектронный умножитель.
ных Cа2+-депо и последующий вход Cа2+ в перитонеальные макрофаги крысы [2-4]. C использованием широкого спектра агентов, влияющих на компоненты сигнальных систем в клетках, нами впер вые показано, что ключевыми участниками сигнального каскада, запускаемого GSSG и глутоксимом и приводящего к увеличению [Ca2+] в макрофагах, являются тирозинкиназы и тирозинфосфатазы [3,5], фос-фатидилинозитолкиназы [6], важнейшие ферменты фосфоинозитидной системы передачи сигнала - фосфолипаза C и протеинкиназа C [7]. Выявлено также участие элементов актино-вого цитоскелета [8] и микротрубочек [9] в действии глутоксима или моликсана на [Ca2+] в макрофагах.
К роме того, обнар ужено, что глутоксим или моликсан сами вызывают рео рганизацию акти-нового цитоскелета в макрофагах: кортикальный слой становится более широким и «рыхлым» и появляются скопления актина в цито-золе [8]. Показано также участие G-белков малой молекуляр ной массы суперсемейства Ras и процессов везикулярного транспорта в действии глутоксима и моликсана на [Ca2+] в макр офагах [10,11].
Одним из ключевых участников процесса формирования устойчивых филаментов из мономер ов G-актина является комплекс Лгр2/3 (Лсйп-R elated Proteins), со стоящий из семи эво-люционно-консервативных белков. Агр2/3 стабилизирует интер медиаты, со стоящие из двух
мономеров актина, стимулируя ветвление фи-ламентов Б-актина [12]. Таким обр азом, Лгр2/3-комплекс представляет собой фактор, усиливающий нуклеацию нитей актина. Комплекс Лгр2/3 состоит из двух субъединиц - Лгр2 и Лгр3, имеющих близкое структурное сходство с мономерами актина, а также пяти дополнительных субъединиц [12]. После сборки комплекс направляется к точкам полимеризации новых актиновых филаментов, связывается с существующим филаментом и выстраивается так же, как актин располагается в димере. Таким обр азом, комплекс Лгр2/3 служит ключевым элементом для формирования новых фи-ламентов, которые вытягиваются под углом 70° к уже существующим филаментам и образуют плотную сеть Б-актина [12].
Лгр2/3-комплекс уча ствует в различных клеточных процессах, требующих реорганизации актиновых филаментов, таких как перестройка кортикального актина, формирование филло-подий, регуляция фор мы и тр анспорта эндосом, процессы эндо- и экзоцитоза [13]. Комплекс Лгр2/3 активируется пр и активации рецепто ров с собственной тирозинкиназной активностью, рецепто ров, связанных с в-белками, а также рецепто ров интегринов. В макрофагах Лгр2/3-комплекс участвует в процессах миграции и хемотаксиса [14].
В связи с этим, для дальнейшего исследования участия актиновых филаментов и актин-связывающих белков, а также процессов везикулярного транспорта и экзоцитоза в сигнальном каскаде, запускаемом глутоксимом и мо-ликсаном, представлялось целесообр азным исследовать возможное участие Лгр2/3-комплекса в действии глутоксима и моликсана на [Са2+] в макрофагах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки. Эксперименты проводили на культивируемых резидентных перитонеальных макрофагах крыс линии Резидентные макрофаги выделяли из перитонеальной полости крыс массой 180-250 г. Сразу после выделения клетки имели сферическую форму и диаметр 10-20 мкм. Суспензию клеток помещали в бак-печатки, содержащие кварцевые стекла размером 10 х 10 мм. Клетки на стеклах культивировали в течение 1-3 сут при 37°С в среде 199 (рН 7,2), содержащей 20% сыворотки крови быка, глутамин (3%), пенициллин (100 ед./мл) и стрептомицин (100 мг/мл). Тест на а-нафтил-эстеразу показал, что по меньшей мере 96% клеток в монослоях были макрофагами. Эксперименты проводили при комнатной темпера-
тур е 22-24°C чер ез 1-2 сут после начала культивирования клеток. Квар цевые стекла с клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную физиологическим раствором следующего ионного со става (мМ): 140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 5 HEPES-NaOH, рН 7,3-7,4. Бескальциевая среда отличалась тем, что содержала 1 мМ ЭГТА и не содержала Cа02. Подробно процедура культивирования макрофагов описана ранее [8].
Иcпользованные pеактивы. Для выявления участия Лгр2/3-комплекса в действии глутоксима и моликсана на [Ca2+] в макрофагах использовали новый эффективный низкомолекулярный ингибитор комплекса Лгр2/3 - соединение C К-0944666 [15,16]. Маточный р а створ глутоксима (50 мг/мл) и моликсана (50 мг/мл) (ФАРМА-ВАМ, Москва) готовили на воде, маточный р аствор соединения CK-0944666 (100 мМ) (Sigma-Aldrkh, CША) - в диметил-сульфоксиде.
Для измеpения [Ca2+]i ^пользовали флуо-pеcцентный зонд Fura-2AM (Sigma-Aldrich, CША). Макрофаги инкубировали в течение 45 мин в физиологическом р аствор е, содержащем 2 мкМ Fura-2AM, пр и комнатной температур е. ^екла с окрашенными клетками отмывали физиологическим раствором и пер ено -сили в экспериментальную камеру, расположенную на столике флуоресцентного микроскопа Le^a DM 4000B (Leka Mkrosystems, Германия). Для возбуждения флуор есценции Fura-2AM использовали осветитель микроскопа Leka DM 4000B, источником света в котором является ксеноновая лампа мощностью 75 Вт. Возбуждение флуоресценции объекта пр оизводили при длинах волн 340 и 380 нм через объектив микроскопа. Для выделения соответствующих уча -стков спектра использовали узкополо сный оптический фильтр. Эмиссию регистрировали при длине волны 510 нм при помощи фотоэлектронного умножителя (ФЭУ 85), встроенного в оптическую систему микроскопа. ^гнал с ФЭУ усиливали специально сконструированным усилителем. Для оцифровки сигнала с ФЭУ и управления функциями микроскопа использовали специализированный микроконтроллер на базе микропроцессора ATMEGA 168, подключенного к компьютеру через USB-интерфейс. Для управления экспериментом использовали оригинальное программное обеспечение. В экспериментах применяли объектив 10х с апертурой 8 мм. Для избежания фотовыгорания измерения проводили через каждые 20 с, облучая объект в течение 2 с. Значения [Ca2+] рассчитывали по уравнению Гринкевича [17]. ^алогический анализ проводили с примене-
Агр2/3-КОМПЛЕКС УЧАС ТВУЕТ В ДЕЙ С ТВИИ ГЛУТОК С ИМА
909
Рис. 1. Влияние соединения СК-0944666 на эффект моликсана на [Са2+] в макрофагах. (а) - Клетки инкубировали в течение 20 мин в присутствии 100 мкг/мл моликсана в номинально бескальциевой среде, после чего вход С а 2+ инициир овали введением в нар ужную ср еду 2 мМ С а 2+; (б) - клетки пр едвар ительно инкубир овали в течение 1 ч с 100 мкМ СК-094666 в бескальциевой ср еде, затем добавляли 100 мкг/мл моликсана, чер ез 20 мин вход С а 2+ инициир овали введением в нар ужную ср еду 2 мМ С а 2+. Здесь и на р ис. 2 каждая р еги стр ация получена для группы из 40-50 клеток и представляет собой типичный вариант из шести-семи независимых экспер иментов.
нием г-кр итер ия Стьюдента. Данные пр едстав-лены в виде х ± sx. На рисунках приведены р езультаты типичных эк спер иментов.
Для выявления и усиления входа Са2+ в клетки использовали классическую схему эксперимента (Са2+-:&ее/Са2+-гет1гоёис1;юп рго1о-со1). Макр офаги инкубир овали в номинально бескальциевой ср еде, затем на них действовали глутоксимом или моликсаном, вызывая мобилизацию Са 2+ из внутр иклеточных депо. После добавления в наружную ср еду 2 мМ С а2+ и восстановления физиологического градиента концентрации Са2+ наблюдали быстрое повышение [Са2+]1, отр ажающее в ход Са 2+ в клетку. Ингибитор Агр2/3-комплекса добавляли за 1 ч до введения глутоксима или моликсана.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В контрольных экспериментах показано, что инкубация макрофагов в течение 20 мин с 100 мкг/мл моликсана (р ис. 1а) или 100 мкг/мл глутоксима (р ис. 2а) в номинально бескальциевой ср еде вызывает медленно нар а ста
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.