УДК 577.113.3
АРСЕНОЛИЗ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ СПОСОБЕ ПОЛУЧЕНИЯ РИБАВИРИНА. ИНГИБИРОВАНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА А in vitro И in vivo С ПОМОЩЬЮ КОМБИНАЦИИ РИБАВИРИНА
И ОЗЕЛЬТАМИВИРА
© 2013 г. И. Д. Константинова*, #, И. В. Фатеев*, Г. А. Галегов**, П. Г. Дерябин**, А. Г. Ботиков**, И. С. Музыка*, Д. К. Львов**, А. И. Мирошников*
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **ФГБУ "НИИвирусологии им. Д.И. Ивановского"Минздрава РФ, Москва Поступила в редакцию 22.02.2013 г. Принята к печати 04.04.2013 г.
Усовершенствован биотехнологический способ получения противовирусного препарата рибавири-на по реакции трансгликозилирования добавлением каталитических количеств арсената натрия в реакционную смесь. Такой подход позволяет гидролизовать избыточное количество природного нуклеозида — донора рибозы гуанозина и, как следствие, упростить состав реакционной смеси и процесс выделения рибавирина. Показано, что комбинация препаратов рибавирина и озельтамиви-ра карбоксилата снижает репродукцию вируса гриппа А в культуре клеток по сравнению с каждым препаратом, взятым в отдельности. Аналогичные результаты получены в экспериментах на лабораторных животных (белых мышах Balb/C), инфицированных вирусом гриппа А H3N2/Aichi/68.
Ключевые слова: 1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид, рибавирин, вирамидин, реакция трансгликозилирования, нуклеозидфосфорилазы E. coli, грипп А, озельтамивира карбоксилат.
DOI: 10.7868/S0132342313050096
ВВЕДЕНИЕ
Комбинированная химиотерапия вирусных инфекций двумя и более препаратами с различным механизмом антивирусного действия, как хорошо известно, играет важную роль в лечении ВИЧ/СПИД инфекции и вирусных гепатитов В и С. Хотя для лечения гриппозной инфекции комбинации препаратов в практике не применяются, на экспериментальном уровне уже давно продемонстрирован высокий уровень антигриппозного действия комбинации амантадина (ремантадина) и рибавирина in vitro и in vivo [1].
Недавно американские вирусологи обнаружили, что тройная комбинация амантадина, озельта-мивира и рибавирина обладает in vitro и in vivo высоким уровнем антигриппозного действия [2, 3].
Рибавирин (I, 1^-.0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид, Виразол) — модифицированный нуклеозид, действующий в отношении широкого спектра РНК- и ДНК-вирусов. Обла-
Сокращения: ТСА — 1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид; СВ50 — 50% цитотоксическая доза; ЦПД — вирусспецифи-ческое цитопатогенное действие; РКР — пуриннуклеозид-фосфорилаза.
# Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-72-47; факс: +7 (495) 330-73-29; эл. почта: kid1968@yandex.ru).
дает выраженным лечебным действием при гепатите С, лихорадке Ласса, а также при гриппе А- и В-типов [2].
Озельтамивир (II, осельтамивир) — противовирусный препарат, относится к группе ингибиторов нейраминидаз, блокирует репликацию вирусов гриппа типа А и Б [4].
HO
O
N-д
i N N
NH2
O
OH
OH
(I)
O
oxr4"
HN
A
O
NH2 (II)
Рибавирин (I) и озельтамивир (II).
Настоящее сообщение посвящено изучению комбинированного действия рибавирина как универсального ингибитора репродукции вирусов гриппа и ингибитора нейраминидазы вируса гриппа озельтамивира на гриппозную А инфекцию in vitro и in vivo.
Обоснованием для проведения таких исследований послужили не только результаты американских коллег, но и наши более ранние эксперименты по изучению противогриппозного действия ремантадина совместно с рибавирином [5]. В этом плане по-новому вырисовываются противогриппозные свойства рибавирина. Мы считаем перспективным его применение в комбинированной терапии гриппозной инфекции, вызванной наиболее опасными в пандемическом плане вирусами животного происхождения.
Хорошо известно, что к рибавирину не формируются устойчивые штаммы вируса гриппа и в настоящее время рибавирин является обязательным препаратом при лечении гепатита С и входит в новый стандарт терапии: рибавирин-телапривир-интерферон-альфа [6, 7]. В связи с этим представляется важным проведение цикла исследований по созданию высокоэффективного биотехнологического способа получения субстанции препарата рибавирина.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Способ получения 1- Р^-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида
Химико-ферментативный (биотехнологический) подход к синтезу рибавирина и его аналогов вытесняет в настоящее время многостадийные химические процессы, позволяет осуществлять ключевые превращения с высокой эффективностью, регио- и стереоселективностью [8, 9]. Основу биотехнологического способа синтеза рибави-рина составляет реакция трансгликозилирования — ферментативная реакция переноса рибозы природного нуклеозида, гуанозина или инозина, на 1#-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (ТСА). Эта реакция катализируется бактериальной пуриннук-леозидфосфорилазой (РМР), которая, в отличие от РМР человека, способна воспринимать ТСА и его структурные аналоги в качестве субстрата [10]. Механизм реакции трансгликозилирования представлен на схеме 1 [11—13]. При проведении реакции в фосфатном буфере промежуточным продуктом ее является а^-рибозо-1-фосфат, образующийся в активном центре фермента.
HO-CH
PNP
OH
IB
OH
HO-CH
Г1
OH
0
II
O-P-O-
1
OH OH
HO-CH
r\
PNP, B'
OH
B'
OH
B = природное гетероциклическое основание;
B' = модифицированное гетероциклическое основание.
Схема 1. Механизм реакции трансгликозилирования.
B
При выборе источника рибозы предпочтительнее оказалось использовать гуанозин, т.к. образующийся в процессе реакции гуанин выпадает в осадок, смещая равновесие ферментативной реакции в сторону образования рибавирина. Степень конверсии ТКА в рибавирин составляет 98% при использовании гуанозина и 67% при использовании в качестве донора рибозы инозина.
Ранее мы сообщали о возможности синтеза ри-бавирина с помощью генно-инженерной РМРиз штамма-продуцента E. саН BL21(DE3)/pER-РиРНН01 (КФ 2.4.2.1) [14-16]. В соответствии с разработанной нами методикой, 1,2,4-триазол-3-карбоксамид и гуанозин вводили в реакцию трансгликозилирования в фосфатном буфере при 60°С в присутствии иммобилизованных
ферментов [8]. Выход составлял 67%. Однако при масштабировании этой технологии оказалось нецелесообразно использовать иммобилизованные ферменты, т.к. из-за кристаллизации образующегося в реакции гуанина на макропористом стекле активность иммобилизованных на нем ферментов постепенно снижалась. Кроме того, по окончании реакции кроме рибавирина в реакционной смеси присутствует избыточное количество гуанозина и гетероциклические основания, гуанин ^иа) и ТСА. Следовательно, для выделения целевого продукта, рибавирина, необходимо было использовать хроматографию. Данные ВЭЖХ стандартной реакционной смеси приведены на рис. 1.
AU 2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
% Composition 100
80
- 60
40
- 20
10
12 14
Minutes
0
6
2
4
8
Компоненты смеси Rt, мин Площадь, %
ТКА 2.156 0.81
Рибавирин 2.436 75.26
Гуанин 2.934 0.79
Гуанозин 6.981 23.14
Рис. 1. Данные ВЭЖХ реакционной смеси синтеза рибавирина (I) после охлаждения до комнатной температуры и удаления осадка гуанина.
В этой связи встала задача усовершенствования условий реакции трансгликозилирования для получения рибавирина. Мы обнаружили, что при добавлении в реакционную смесь каталитических количеств арсената натрия Ма2НАЮ4 (до 0.5 мМ) избыточное количество гуанозина в реакции в течение 2 ч быстро гидролизуется до гуанина, который при охлаждении до +4-8°С выпадает в осадок практически нацело. В результате состав реакционной смеси становится более простым (рис. 2).
Процесс арсенолиза природных нуклеозидов известен давно, и его механизм хорошо изучен [17, 18]. В присутствии солей мышьяковой кислоты в активном центре РМР из нуклеозида образуется интермедиат, а^-рибозо-1-арсенат, который крайне неустойчив в водных растворах и быстро диссоциирует до рибозы и неорганического арсената. В мировой практике арсенаты применяются при гидролизе нуклеозидов до гетероциклических оснований [17, 18].
ho-ch
OH X
в PNP
Na2HAsO4
ho-ch
CH2 г»
сг" ^ 0
^ Г O-As-O-
"" OH
HO-CH
+ в-
OH X
OH + HAsO- + B
OH x
X = OH, H
Схема 2. Схема арсенолиза природных нуклеозидов гуанозина, инозина и аденозина PNP E. coli.
Исследуя субстратную специфичность PNP что фермент эффективно катализирует превра-E. coli в реакции арсенолиза, мы обнаружили, щение только природных нуклеозидов пурино-
вого типа: гуанозина, инозина, аденозина и их ближайших структурных аналогов. На рис. 3 приведены кинетические кривые накопления гуанина в реакциях фосфоролиза, арсенолиза,
а также параллельного проведения этих реакций. Видно, что арсенолиз гуанозина в указанных условиях завершается через 3 ч (98—99% гуанина).
OH
O
N-¡i—С,
^ N NH2
N
H
(Iii)
¿O
!2
HO-CH
H2N N
+
2
1) PNP, KH2PO4, 150 h
OH OH (IV)
O
N-¡i—С
N nh2
OH
2) Na2HAsO4, 3 h
HO-CH2 ~ N
+
OH OH (I)
IX?
H2N N N
(V)
H
Схема 3. Синтез рибавирина с применением арсената натрия.
Мы также установили, что рибавирин является "плохим" субстратом для PNP E. coli', его фосфо-ролиз до ТСА проходит всего на 2.3% за 4 ч термо-статирования (линия Р, рис. 4) и он практически не подвергается арсенолизу — 0.16% за то же время (линия А) (рис. 4).
Это наблюдение позволило нам так подобрать условия ферментативного синтеза рибавирина (содержание фосфата калия и арсената натрия в реакционной смеси), что удалось селективно вывести из реакции избыточное количество гуанозина, практически не гидролизуя целевой продукт до ТСА. Изменение содержания компонентов реакционной смеси синтеза рибавирина после добавления арсената представлены на рис. 5.
Синтез рибавирина осуществляли следующим образом: 1,2,4-триазол-3-карбоксамид смешивали с гуанозином (в молярном соотношении 1 : 2) в калий-фосфатном буфере, добавляли PNP и смесь термостатировали при температуре 60°С в течение несколько дней. Когда конверсия ТСА в рибавирин по данным ВЭЖХ достигала 97—98%, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры для осаждения гуанина. После удаления осадка из реакционной смеси в нее добавляли каталитиче
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.