БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 1034-1039
ДИСКУССИИ: -
УДК 577.34 + 577.15
АР ТЕФАКТЫ КОНФОКАЛЬНОЙ МИКР ОСКОПИИ
© 2014 г. Н.Л. Векшин, М.С. Фролова
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области E-mail: nvekshin@rambler.ru Поступила в p едакцию 09.06.14 г.
Ра ссмотрены некоторые типичные артефакты, возникающие при использовании конфокальной флуоресцентной микроскопии при изучении структуры и динамики живых клеток. Обсуждается роль светорассеяния, подвижности, неспецифичности окрашивания, локальных концентраций и др.
Ключевые слова: конфокальная микроскопия, люминесцентная микроскопия, флуоресцентные зонды, светорассеяние, латекс, нейробластома, митохондрии.
Поскольку флуориметрическая детекция гораздо более чувствительна, чем фотометрическая, в оптической микр оскопии клетки большое распро стр анение получило применение специализированных флуоресцентных микроскопов, особенно конфокальных, где возбуждающий свет сфокусир ован в точку, а собираемое излучение ограничено специальной апертурной диафрагмой [1]. Красивые картинки, получаемые за счет окрашивания клеток флуоресцентными красителями, настолько наглядны и убедительны, что у большинства исследователей даже не возникает мысли о том, что интерпретация результатов может иметь какие-либо альтернативы. Однако флуоресцентная микроскопия, особенно конфокальная, может иногда давать ряд артефактов, приводящих при отсутствии специальных контрольных опытов к некорректным выводам. Некоторые методические вопросы обсуждались в работе [2]. П редставляет интерес рассмотреть все «подводные камни».
Считается, что конфокальный микроскоп всегда создает значительный контраст (за счет апертурной диафрагмы, размещенной в плоскости изображения и ограничивающей поток фонового рассеянного света) по сравнению с обычным микроскопом. Это верно для фиксированных обр азцов. Для нативных образцов в ряде случаев все может быть наоборот. Поскольку конфокальный микроскоп в каждый момент времени регистрирует изображение только одной точки объекта, а полное изобра -жение строится путем сканирования, то это означает, что подвижность образца будет при-
Сокращение: DCF-DA - 2',7'- дихлорфлуоресцеин диаце-тат.
водить к pазмытию картинки. Для суспензий и живых клеток конфокальный микро скоп иногда дает менее контрастное изображение, чем обычный.
Во многих конфокальных микр оскопах паразитный фоновый свет, проникающий от мощного лазера или лазерного диода в канал регистрации, устраняется в основном самой кон-фокальностью, малой апертурой [1]. Хотя при малой апертуре паразитный свет мало проникает на детектор, но все же проникает, имитируя тем самым флуор есценцию. П риведем пример ы.
На рис. 1 (спр ава) показана «флуоресцентная» картинка, полученная на конфокальном микро скопе FluoView FV10i-w (01ушри8, Австрия) от нефлуоресцир ующего образца - тонкого ср еза луковицы обычного белого лука, в клетках которого нет никаких светопоглощающих и излучающих хромофоров. Наиболее интенсивный «цвет» дают стенки клетки там, где происходит максимальное светорассеяние. П ри фазовом контрасте (р ис. 1, слева) именно стенки дают наиболее интенсивный сигнал. П ри этом «флуор есцентное» изображение (р ис. 1, справа) было получено при максимальной конфокаль-ности, т.е. при минимальной апертуре 1. Аналогичная картинка, хотя и менее выраженная, была получена на конфокальном микроскопе Andor (Andor TeAnology, Великобритания), в котором для защиты от паразитного света применены светофильтры (в обоих каналах - возбуждения и эмиссии).
На рис. 2 показаны фотографии, полученные от заведомо нефлуоресцирующих латекс-ных частиц диметром 1,5 микрон на конфокальном микроскопе FluoView FV10i-w (Olym-
Рис. 1. Фотографии клеток белого лука (ширина клетки - около 30 микрон). Конфокальный микроскоп FluoView FVl0i-w (Olympus) в режиме «фазовый контраст» (слева) и «зеленая флуоресценция» (справа), апертура = 1. Возбуждающий лазер 473 нм.
Рис. 2. Фотографии латексных частиц диаметром 1,5 микрон. Конфокальный микроскоп FluoView FV10i-w (01утрш) в режиме «фазовый контраст» (слева) и «зеленая флуоресценция» (справа), апертура = 1. Возбуждающий лазер 405 нм.
pus) при максимальной конфокальности (при апертуре 1) в режимах «фазовый контраст» и «зеленая флуоресценция». Все «зеленые» точки возникают исключительно в результате светорассеяния, так как латекс не обладает способностью к флуор есценции. П р и увеличении апертур ы количество «светящихся» частиц возрастает многократно (на рисунке не показано). Это означает, что в случае слабой собственной флуоресценции клеточных органелл или слабой флуоресценции красителя в низкой концентрации паразитный свет может дать в изображение слишком большой вклад, что сделает интерпретацию затруднительной.
В отличие от конфокального микроскопа, эпи-микро скоп (Z1 Axio Vs40, Zeiss, Гер мания)
не давал никакого «зеленого» сигнала от латекса. При этом данный микроскоп позволил хорошо детектировать собственную флуоресценцию органелл (данные не пр иводятся). Эпи-микро скопы обычно имеют источником возбуждения светодиоды или лампу с отдельными ртутными линиями, а также снабжены светофильтр ами и иными пр испособлениями, эффективно отсекающими паразитный фоновый возбуждающий свет.
Когда краситель встраивается в частицу, например органеллу, его коэффициент экстинк-ции, как правило, заметно снижается. Это связано с тем, что частица рассеивает возбуждающий свет [3], т.е. уменьшается вероятность попадания фотонов внутрь частицы, что приводит
1036
ВЕКШИН, Ф РОЛОВА
Рис. 3. П рокрашивание клеток нейробластомы человека флуоресцентным красителем MitoTradcer Green. Конфокальный микроскоп Leica TCS SP5, возбуждение 405 нм, «зеленая» флуоресценция. Обработка изображения в программе ImageJ.
к о слаблению интенсивности флуоресценции. Иногда спасает ситуацию то, что квантовый выход излучения красителя в воде низкий, а в органелле высокий (из-за меньшей полярности) [4]. Интенсивность флуоресценции окрашенных органелл сильно зависит от их размеров. Чем больше размер частицы, тем сильнее рассеяние и слабее флуоресценция [3]. Нельзя напрямую ср авнивать яркость изображения органелл разных размеров. Например, окрашенные органел-лы диаметром 1 мкм будут флуоресцировать слабее, чем органеллы диаметром 0,5 мкм (но при этом могут давать на конфокальном микроскопе больший вклад как паразитные точки рассеяния, имитирующие собой флуоресценцию).
Поскольку величина светорассеяния, как известно, зависит от показателя преломления (n) очень резко - в четвертой степени [3], сильное окрашивание частиц при невысоком квантовом выходе флуоресценции красителя приводит к увеличению их n и, как следствие, к усилению рассеяния, к дополнительному попаданию на детектор пар азитного света. Е сли при прокра -шивании органелл величина n возрастет от ~ 1,5 до ~ 2,0 (в полосе возбуждения все красители имеют n > 2), то светорассеяние может увеличиться даже в три раза.
В конфокальном микроскопе излучение лазера сильно поляризовано. Поэтому флуоресценция неподвижного объекта тоже сильно поляр изована, а вр ащающегося - деполяризована [4]. Это означает, что разная интенсивность флуоресценции различных субклеточных структур может вызваться отличием в их вращатель-
ной подвижности, т.е. при сравнении отдельных областей клетки нельзя их различия в интен-сивностях однозначно интерпретировать только как разницу в прокрашивании или в квантовом выходе.
Конфокальная микроскопия, как правило, проводится с пр именением заряженных или поляр ных флуоресцентных красителей. К сожалению, большинство таких красителей нарушают нормальные функции живой клетки [4]. Например, ДНК-тропные красители расплетают ДНК, липидо-тропные - увеличивают проницаемость мембран, кальций-тропные со рбируют на себя весь цитоплазматический кальций, протон-тропные сдвигают внутриклеточный рН и «за-буферивают» цитоплазму и т.д.
Многие красители считаются специфичны -ми, т.е. прокрашивающими только определенные органеллы [5]. Некоторые фир менные кра -сители даже имеют особое название, указывающее на тип органелл, котор ые они окрашивают: митотрекер (МкоТгаскег), лизотрекер (Ьу80-Тгаскег) и т.п. У исследователя возникает полная уверенность, что в клетке он будет видеть именно митохондрии, лизосомы и т.д. Однако на самом деле в большинстве случаев красители не является строго специфичными, пр ичем это не всегда является результатом избыточного «перекрашивания». Например, было показано [6], что митотрекер зеленый красит не только митохондрии, но и фибриллярный актин, который плотно связан с митохондр иями и регулирует их подвижность. На рис. 3 приведено изображение, полученное нами на конфокальном микр оскопе Ьеюа ТСБ БР5 при пр окрашивании клеток нейробластомы митотрекером зеленым. Точечные структуры на фото - это митохондрии, а нитевидные, вероятно, - акти-новые нити (в любом случае это не митохондрии).
Многие исследователи ошибочно принимали нити актина за нитевидные митохондрии. Для того чтобы убедиться в этом, достаточно было провести сукцинат:тетразолий-редуктаз-ную реакцию (сукцинатдегидрогеназа есть только в митохондриях) [7] или окрасить митохондрии акридиновым оранжевым, этидий бромидом или 7-аминоактиномицином, котор ые про -крашивают митохондриальную ДНК [8], но не актиновые нити. Многие микроскописты, не делавшие такие контрольные опыты, пришли к ошибочному выводу о червеобразной или нитеобразной форме митохондрий, а некоторые даже заявили о наличии в клетках «сети ми-тохондриального ретикулума» [9]. На самом же деле никаких митохондриальных «сетей» или «гигантских» митохондр ий в большинстве спе-
циализир ованных клеток животных в нор ме не существует [7] (хотя они могут возникать в о собых условиях, о собенно пр и клеточных патологиях), а типичная форма митохондрии -сфер а диаметр ом ~ 1 мкм.
П р иведем еще один пр имер пр облематичной «специфично сти». Для измер ения активных фо р м кислор ода шир око пр именяется кр а ситель 2',7'-дихлор флуоресцеин диацетат (Б СБ -Б А) [10]. При проникновении этого нефлуоресци-р ующего кр а сителя в клетку
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.