БИОФИЗИКА, 2011, том 56, вып. 5, с. 939-944
МОЛЕКУЛЯР НАЯ И КЛЕТОЧНАЯ БИОФИЗИКА =
АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ НАНОСИ СТЕМ
УДК 577.3
АСМ-ВИЗУАЛИЗАЦИЯ, ИЗМЕР ЕНИЕ АКТИВНО СТИ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЕДИНИЧНЫХ МОНОМЕР ОВ И ОЛИГОМЕР ОВ ФЕР МЕНТОВ
© 2011 г. Ю.Д. Иванов, Н.С. Бухарина, Т.О. Плешакова, П.А. Французов, Н.В. Крох ин, В.С. Зиборов, А.И. Арчаков
Учреждение РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
E-mail: yurii.ivanov@rambler.ru Поступила в p едакцию 09.06.11 г.
Изложен подход по измерению активности единичных молекул гемсодержащего фермента цитохрома P450 CYP102A1 (CYP102A1) с помощью атомно-силовой микроскопии. Обнаружено, что амплитуда флуктуаций высоты белковой глобулы единичных молекул фермента CYP102A1, осуществляющих каталитический цикл, больше в два раза, чем амплитуда флуктуаций высоты тех же самых ферментов в неактивном состоянии. Показано, что амплитуда флуктуаций высоты белковой глобулы цитохрома CYP102A1 зависит от температуры, причем максимум этой зависимости наблюдается при температуре 22°C. Pаccчитанная активность единичной молекулы CYP102A1 в единицах амплитуды флуктуаций высоты белковой глобулы, приведенная к единице времени, составляла 5 ± 2 А/с. Упругость отдельной молекулы белка была измерена по величине деформации этой молекулы под действием зонда атомно-силового микроскопа. Использование данных зондов разной геометрии позволило определить интегральный и локальный модули Юнга для мономеров белка путидаредоксинредуктазы из цитохром P450 CYP101 (P450cam)-cодеpжащей монооксигеназной системы, которые составили 37^117 и 1^3 МПа соответственно.
Ключевые слова: цитохром Р450, атомно-силовая микроскопия, единичные мономеры и олигомеры ферментов.
В последнее десятилетие наблюдается большой интерес к исследованию единичных молекул ферментов, их свойств и активности, возникло даже понятие об энзимологии единичных фер ментов [1]. Одним из наиболее распр остра-ненных методов для визуализации и изучения физико-химических свойств единичных макромолекул и макромолекулярных комплексов является метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), который используется для исследования молекул белков, нуклеиновых кислот, вирусов и т.д. [2-6]. В этом методе для изучения свойств белков белковые молекулы иммобилизуются на атомарно-гладкую поверхность. Для визуализации иммобилизованных белков используется один из динамических р ежимов А СМ - полуконтактный режим. Это позволяет получить изображение молекул белков с минимальным воздействием иглы во избежание деструкции
Cокpащения: АCМ - атомно-силовая микроскопия, PdR -путидаредоксинредуктаза, FAD - флавинадениндинукле-отид.
белковой молекулы [7]. В нашей работе полуконтактный режим АC М использовался как для визуализации, так и для измерения активности фер мента P450 CYP102A1 (CYP102A1), катализирующего окисление жирных кислот. Этот белок является самодостаточным ферментом, т.е. для его функционирования не требуются белки-партнеры [8]. Упругость белков обычно измеряется по деформации молекулы под действием давления, оказываемого АCМ-иглой в контактном режиме. Нами предложен другой подход на основе использования не контактного, а полуконтактного режима АCМ, т.е. деформация молекулы белка измеряется в полуконтактном режиме. Его применение было продемонстрировано на примере белка из другой цитохр ом P450 CYP101 ^450сат)-содержа-щей монооксигеназной системы, катализирующей окисление камфоры - путидаредоксинре-дуктазы (PdR). Выбор этого белка обусловлен тем, что известна его кристаллическая структура [9] и он имеет только один каталитический домен флавинадениндинуклеотид (FAD).
нм
Высота, нм
Рис. 1. Изображение мономеров и олигомеров СУР102Л1, адсорбированного на слюде (а), и плотность их распределения по высотам СУР102Л1 (б). Экспериментальные условия: 0,5 мкМ СУР102Л1 в 10 мМ РБ8Б-буфере, рН 7,4 был нанесен на АСМ -чип из слюды, затем АСМ-чип промывали дистиллированной водой и помещали в 2,5 мМ РБ8Б. Температура 22°С. Изображение получено в РБ8Б-буфере в полуконтактном режиме на АСМ Капс^соре 1Уа (Уеесо). Сплошная линия - плотность распределения из АСМ-данных, пунктир и прерывистая линии -рассчитанные распределения мономеров и олигомеров СУР102Л1 соответственно.
АСМ -ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ МОЛЕКУЛЫ ЦИТОХРОМА СУР102Л1
А СМ позволяет визуализировать молекулы белков и измерять их высоту [4]. Эти возможности АСМ можно использовать для визуализации мономеров и олигомеров белков и их идентификации по высотам, как нами ранее было пр одемонстр ир овано на примере молекулы РёИ [4], а также различать единичные молекулы белков и их комплексы с редокс-парт-нерами в сложных мультикомпонентных белковых системах, как было показано на примере цитохром Р450-содер жащих монооксигеназных систем [5,10-12]. В нашей работе с помощью
АСМ был визуализирован цитохром СУР102Л1 и определена степень его олигомеризации. Анализ А СМ -изображений молекул СУР102Л1, иммобилизованных на А СМ -чипе из слюды, по их высотам, проведенный по методике [2], учитывающей наличие двух типов объектов на чипе, показал, что первый тип объектов имеет максимум плотности р аспр еделения на высоте 2,1 ± 0,2 нм, а второй тип объектов - на высоте 2,9 ± 0,5 нм, что пр едполагает: пер вый тип объектов - мономеры, а второй - олигомеры, причем подсчет количества мономеров и оли-гомеров показал их соотношение 0,3:0,7 (рис. 1). Это согласуется с данными [13], где степень олигомеризации фермента СУР102Л1 определялась с помощью седиментационного анализа. Также ранее было показано, что изолированный фер мент СУР102Л1 может существовать в растворе в виде мономеров и агрегатов, причем мономеры обладают слабой активностью по гидроксилированию жирных кислот по сравнению с агрегатами (каталитическая константа для мономеров 10 с-1, для димер ов 50 с-1) [14]. На рис. 1 представлено изображение СУР102Л1, полученное в РБББ буфере, рН 7,4 в полуконтактном р ежиме.
Наряду с АСМ-визуализацией ферментов был проведен мониторинг флуктуаций высоты молекулы фермента СУР102Л1 в процессе реакции гидроксилирования лауриловой кислоты.
А СМ -измерения амплитуды флуктуаций высоты единичных молекул СУР102Л1 (БМ3) про -водили на АСМ Капо8соре 1Уа (Уеесо) в жидкости зондами БКР-БЮ (Уеесо) с константой жесткости 0,32 0,58 Н/м в полуконтактном режиме, анализируя временную зависимость флуктуаций высоты молекул СУР102Л1 по методу, описанному в [15-17]. Для этого область сканирования выбиралась такой, чтобы в А СМ -кадре находилась выбранная молекула фермента. Затем, выбрав эту молекулу, отключали сканирование по медленной оси. Таким образом, получалось изобр ажение сечения одной и той же части молекулы во временной развертке. Частота сканирования устанавливалась максимально возможной (1,0-1,3 Гц). На каждом изображении вычислялось среднеквадратичное значение амплитуды флуктуаций высоты молекулы фермента как среднеквадратичное значение флуктуаций вершины молекулы за вычетом флуктуаций фона от поверхности А СМ -чипа.
Амплитуды флуктуаций высоты молекулы фер мента СУР102Л1 были получены: 1) - в 2,5 мМ РБББ-буфере (среда А), 2) - в пр исутствии его субстрата - лаур иловой кислоты (500 мкМ), (среда Б), 3) - в присутствии одновременно субстрата и КЛБРН (200 мкМ) [реакция гид-
роксилирования] (среда С), 4) - в присутствии ингибитор а фермента 1-фенилимидазола (5 мМ) (среда Б). Невысокая концентрация РВББ-бу-фера была выбрана для уменьшения влияния осаждения солей на поверхность АСМ-чипа, как и в [18].
Получено, что флуктуация высоты иммобилизованного мономера СУР102Л1 была одинаковой по величине во всех этих средах (Л-Б). В то же время для олигомеров СУР102Л1 флуктуация высоты была различной для разных условий: если пр исутствие субстр ата (лаурило-вой кислоты) не влияло на флуктуацию высоты СУР102Л1 и среднеквадратичное значение амплитуды в средах (Л) и (В) с учетом фона от слюды составило 0,6 ± 0,1 А, то в условиях гидкроксилир ования (в среде С), т.е. пр и добавлении донор а электр онов КЛБРЫ в инкубационную среду, наблюдалось увеличение амплитуды флуктуаций до значения 1,4 ± 0,1 А При последующем добавлении в инкубационную среду ингибитора СУР102Л1 1-фенилими-дазола (среда Б) амплитуда флуктуаций уменьшилась до исходного значения 0,6 ± 0,1 А Таким образом, было показано, что мерой активности фермента может быть амплитуда флуктуаций высоты.
На рис. 2 представлена динамика флуктуации высоты олигомера СУР102Л1 во времени в процессе реакции гидроксилирования. Там же для сравнения приведена динамика флуктуации высоты мономера СУР102Л1.
Видно, что амплитуда флуктуации высоты олигомеров СУР102Л1 (Дй0) выше амплитуды флуктуации мономеров (Дйм) в первые 100 с, а затем наблюдается падение Дйо, что может быть связано с самодеградацией СУР102Л1 и понижением активности фермента в процессе функционирования. В самом деле, за время 100 с фермент осуществляет достаточно большое количество циклов гидроксилирования (порядка 5000 циклов).
Из динамики изменения амплитуды флук-туаций молекул была рассчитана активность олигомеров цитохрома СУР102Л1. Активность фермента приводится в единицах амплитуды флуктуаций белковой глобулы, приведенных к единице времени. И скомая величина составила 5 ± 2 А/с. Она р ассчитывалась как отношение максимального изменения амплитуды флуктуа-ций высоты олигомеров на стадии гидрокси-лирования (среда С) по сравнению с условиями, когда в реакционной смеси не было донора электронов (среда В), за период времени, в который это изменение произошло.
Рис. 2. Динамика флуктуации высоты олигомеров и мономеров СУР102Л1. Экспериментальные условия: 0,5 мкМ СУР102Л1 в 10 мМ РВББ-буфере, рН 7,4, был нанесен на АСМ-чип из слюды, затем АСМ-чип промывали дистиллированной водой и помещали в 2,5 мМ РВББ, содержащий лауриловую кислоту (500 мкМ) и КЛБРЫ (200 мкМ). Температура 22°С. Результаты получены в РВББ-буфере в полуконтактном режиме на АСМ Капс^соре 1Уа (Уеесо).
Была получена зависимость амплитуды флуктуаций высоты СУР102Л1 от температуры. Для этой зависимости наблюдался максимум при темпера
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.