научная статья по теме ASP141 И ЦЕПОЧКА ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ ASP141-ASN109-ASP33 ОБЕСПЕЧИВАЮТ АКТИВНОСТЬ И СТРУКТУРНУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ СИАЛИЛТРАНСФЕРАЗ КЛАССА GT80 Химия

Текст научной статьи на тему «ASP141 И ЦЕПОЧКА ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ ASP141-ASN109-ASP33 ОБЕСПЕЧИВАЮТ АКТИВНОСТЬ И СТРУКТУРНУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ СИАЛИЛТРАНСФЕРАЗ КЛАССА GT80»

БИОХИМИЯ, 2015, том SD, вып. S, с. 12S9 - 1297

УДК 577.152.3

Asp141 И ЦЕПОЧКА ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ Asp141—Asn109—Asp33 ОБЕСПЕЧИВАЮТ АКТИВНОСТЬ И СТРУКТУРНУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ СИАЛИЛТРАНСФЕРАЗ КЛАССА GT80

© 2015 Ксяюан Чен1, Юанминг Венг2, Женпинг Ма2, На Ли2, Вейкуинг Хан2, Куи Женг2, Юмей Цей1*, Джянсонг Ченг2*

1 Shandong Agricultural University, College of Animal Science and Veterinary Medicine 27101S, China; E-mail: caiyum@163.com 2 Nankai University, State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology and College of Pharmacy, Tianjin 300071, China; E-mail: jiansongcheng@nankai.edu.cn

Поступила в редакцию 18.12.14 После доработки 04.03.15

Сиалилтрансферазы — это главные ферменты, принимающие участие в биосинтезе физиологически и патологически значимых природных молекул, содержащих в своем составе сиаловые кислоты. В данной работе изучен не обладающий сиалилтрансферазной активностью рекомбинантный белок Pm0160, несущий естественную мутацию D141^Y в мотиве DDG, идентифицированном в сиалилтрансферазах семейств GT52 и GT80. Исследование различных мутантных форм этого белка показало, что единственная аминокислотная замена (Y141^D) приводила к восстановлению его способности к переносу сиаловых кислот. На основании анализа известной структуры кристаллов сиалилтрансфераз класса GT80 установлено, что между тремя консервативными аминокислотными остатками (Asp141, Asn109 и Asp33) внутри молекул этих ферментов возникает цепочка следующих друг за другом водородных связей. Проведенные эксперименты по мутагенезу показали, что цепочка последовательных внутримолекулярных связей между главным функциональным остатком (Asp141) и соответствующими аминокислотами в структурных доменах Nß4, Nß1 и Na1, в большей степени важна для поддержания стабильности белка, чем для ориентации Asp141 в необходимой для катализа конформации.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сиалилтрансфераза, цепочка водородных связей, главный функциональный остаток, стабильность, активность.

Сиаловые кислоты (81а) — это семейство отрицательно заряженных а-кетокислот с 9-член-ной углеродной цепочкой, обычно замыкающих полисахаридные цепи и обнаруженных в клетках всех типов. Эти кислоты принимают участие в разнообразных физиологических и патологических процессах, таких как межклеточные взаимосвязи, передача сигналов, бактериальные и вирусные инфекции, метастазирование опухолей [1, 2]. 81а природного происхождения и ^-аце-тилнейраминовая кислота (№и5Ае), как их главный представитель, присутствуют в различных линкерных структурах, формируемых особыми ферментами — сиалилтрансферазами.

Сиалилтрансферазы катализируют реакцию переноса сиаловой кислоты от субстрата-донора цитидин 5'-монофосфат-81а (СМР-81а) на

* Адресат для корреспонденции.

субстрат-акцептор терминальный остаток галактозы (Gal), лактозы (Lac), ^-ацетилгалакто-замин (GalNAc) или же другой остаток Sia. В настоящее время сиалилтрансферазы были идентифицированы в разнообразных организмах: бактериях, вирусах, в различных органах млекопитающих, и распределены по пяти классам гликозилтрансфераз (GT): GT29, GT38, GT42, GT52 и GT80, в соответствии с особенностями их структуры (CAZy-Carbohydrate-Active enZyme database, http://www.cazy.org/). Кроме того, сиа-лилтрансферазы бактериального происхождения широко используются для синтеза различных Sia-содержащих структур, поскольку бактериальные ферменты обладают гибкой субстратной специфичностью и продуктивно экспресси-руются в клетках Escherichia coli [3, 4].

Установлено, что сиалилтрансферазы млекопитающих содержат в первичной последова-

тельности небольшие консервативные мотивы, такие как L, S, VS и III. Эксперименты по сайт-специфическому мутагенезу показали, что эти мотивы вносят вклад в связывание субстрата-донора, -акцептора или их обоих [5, 6]. Недавно в бактериальных (поли)сиалилтрансферазах семейств GT38, GT52 и GT80 были обнаружены два высококонсервативных пептидных мотива: (1) D/E-D/E-G и (2) H-P [7]. Причем, чередование Asp (D)/Glu (E) в мотиве (1) было характерно для ферментов класса GT38 [7], тогда как для

ферментов классов GT52 и GT80 этот консервативный мотив (1) был строго D-D-G (рис. 1, А). Поэтому короткая консервативная последовательность D/E-D/E-G была названа мотивом DDG в отношении сиалилтрансфераз классов GT52 и GT80.

Мотив DDG (Asp164-Asp165-Gly166) сиа-лилтрансферазы из Neisseria meningitidis (NST), относящейся к классу GT52, по-видимому, важен скорее для структуры, чем для катализа, поскольку отделен от активного центра фермен-

А

Ш 2

1 о

В

2ihz

РМ0160

q9cp67

A5LHX0

A8QYL0

a8rqy0

а8е0т5

DQVYB7

066375

A8QYL1

q7vpl1

2IHZ

gt52

gt80

С

m

25

мк S к S к NK nk nn ар ар ар ар QQ

(И р5 ■►IT^

titl l 2 г sl 7 j р i j i j 1 j j j j alnqlm df tq . nn e dk t hp r i fgls j fk i p d hi i tqyqn. . ih f velkdnrp

titl l 2 р sl alnqlm df tq . nn e dk t hp r i fgls fk i p d hi i tqyqn. . ih f velkdnrp

т itl l j р sl almqlm df tq . nn e dk t hp r i fgls i i j fk i p d n1 i tqyqn. . ih f velkdnrp

т i ev v ■ r ! т l tiqqmt ql i n * * . e ns n nk к li sws yp i n d et l l e s i n . . gs f fk____nr

т i ev v ■ » r т l tiqqmt qi i n e ns n nk к li sws yp i n d ee l lesin. . gs f fk....nn

а i е 1 v 2 r ть tiqqmt ki vs q kt s nk К lisws i i i i i £ yp i t d ks L lkkin. , ae f fk....eq

tlev v 1 Н sl slqqlm ki iq qkn e ys q ne r fiswg i r l t e dn a eklna. . h i y plagnnts

tlev v Н sl s lqqlm ki iq qkn e ys q ne r fi swg ig l t e dn a eklna, . hi y plagnnts

tlev i н sl slqqli hi iq akd e yp s nq r fvswk vt v d a dn a nklni. . ht y plkgnnts

slev v н sl t l q q l m d i ik see e np t aq r y i awg i v p t d eq m kelni . . ts f alinnhtp

nle i ь y Т I s lacfm hf 1q . hk d dv d s i r lfgla fd i p 2 s i i dry panhl f y hnidnrdl

аЗ

JULSLQJLQJL

«4

ммммшм

Р7

об

SLQJLQJLQJLSL

2IHZ t eal ft i ldq y p g n . . I e l n hl i ahs vql i rp l ayr fkhld rv s i qq lnl yd i gs me yg d l

PM0160 t eal ft I ldq y p g N . . I e L d hl I aiis vql I rp l ayr fkhld ev s i qr lnl yd 1 gs me yk d l

Q9CP67 t eal ft i ldq y p g N . . IE l d hl I ahs VQL i rp l ay r fkhld rv siqr lnl yd 5 gs me yb d l

A5LHX0 p eli ks l dsm i L t NE ikk v I ng t lwa vd . v vn I ks , iealg kk ТЕ i e lnf yd i gs aeyb r l

A8QYL0 s eli ks l dsm i l t nd ikk v i ng t lwa ad , v VN .: ks , ieafg k.k те i e lnf yd i gs ae yb r l

A8R0Y0 f elt. es i, kni i l s en i dn Tj i hg t lws I d . v VD t ke . vnllg kn trie lhf yd d gs ae yb r i

A8R0T5 Q elv da v idy a d s kn RLN ii e l nt t ghs frn i ap l ra . tsskn n1 li sn inl yd d gs ae yk s i,

DQVYB7 Q elvj da v idy a d s kn RLN l e l NT T ahs fpn l ap l r i . issks n1 li sn inl yd ; gs ae yB n l

066375 p em v aa i DEY a q s KN rln i e f YT T ан V fnn l pp i qp . lynne kv ki SH i sl YD g g SE yB s L

A8QYL1 a dlv QE i vkq a q t kh rln v к L SS T ahs fdn l vp l ke , lns fn nv TVTN i dl yd gs ae yB n l

Q7VPL1 T avl nq l AD I L A q ENKRFQ i N L HL L fhs I DL f FA Y pi yqqyqh| ki STI Q lolhed gs EGlB T £

258

Рис. 1. Логографическое изображение последовательности мотива DDG и окружающих его аминокислотных остатков было выполнено на основе выровненных последовательностей сиалилтрансфераз классов GT52 и GT80. Высота букв соответствует частоте встречаемости соответствующей аминокислоты в различных выровненных последовательностях (А). Выровненные N-концевые последовательности различных сиалилтрансфераз класса GT80. Аминокислотные остатки, формирующие цепочку водородных связей (Asp141— Asn109—Asp33), помечены черными крестиками. В выровненную последовательность фермента PmST1 (2IHZ) не включены первые 24 а.о. (В). Логографическое изображение последовательности аминокислотных остатков, окружающих главную функциональную группу (остаток Asp258 был идентифицирован как главный в ферменте из бактерии Neisseria meningitides серотипа L1), выполнено на основе выровненных последовательностей сиалилтрансфераз класса GT52 (С)

та структурой петля—спираль—петля [8]. И напротив, в ферментах класса GT80 второй остаток аспарагиновой кислоты (Asp141) в этом мотиве является главным функциональным остатком и отнимает протон у 3'-ОН лактозы (Lac), что делает группу 3'-О- более сильным нуклеофилом для атаки на аномерный атом С2 в CMP-Neu5Ac [9]. К настоящему времени известны структуры четырех сиалилтрансфераз класса GT80 в своей апо-форме, либо в комплексе с СМР или в комплексе с CMP-3FNeuAc и Lac [9—12]. Основываясь на информации о структуре (рис. 1, В и 2, В), можно проследить формирование цепочки водородных связей между консервативными аминокислотными остатками (а.о.) Asp141, Asn109 и Asp33 в молекулах этих ферментов. Помимо этого, главный функциональный а.о. Asp141 локализуется на небольшой петле, соединяющей домены Nß5 и Na5, а а.о. Asn109 и Asp33 располагались в концевых частях доменов Nß4 и Nß1 соответственно. Далее, а.о. Asp33 взаимодей-

ствовал с a-спиралью Nal посредством водородной связи, формируемой атомом кислорода бокового радикала а.о. Asp33 и атомом ^-пептидной связи, образуемой а.о. Ala39 (либо Thr или Ser в других ферментах класса GT80) (рис. 2, В). Предположений о роли этой цепочки водородных связей не существует и исследований в этом направлении ранее не проводилось.

Недавно при изучении генома вирулентного штамма Pasteurella multocida 671/90 [13] было установлено, что предполагаемая сиалилтранс-фераза Pm0160, последовательность которой была выведена из структуры гена pm0160 этой бактерии, несла мутацию Asp141^Tyr в мотиве DDG (рис. 1, В). Учитывая тот факт, что главные функциональные остатки в сиалилтранс-феразах класса GT52 или, по крайней мере, места их расположения, не являются консервативными (рис. 1, С), было бы интересным выяснить, может ли а.о. Tyr141 заменить Asp141 и функционировать как главный в ферменте

Рис. 2. Схематическое изображение цепочки водородных связей в активном центре фермента Рт8Т1 (21Н/) (А); изображение представленных в различной ориентации цепочек водородных связей в активных центрах четырех сиалилтрансфе-раз класса вТ80 (21Н/, 2/4Т, 2ZWI и 21У8) (совмещены соответству

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»