ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 2, с. 236-242
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 577.21:616.1
АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ ФАКТОРОВ ВОСПАЛЕНИЯ С ИНФАРКТОМ МИОКАРДА
© 2014 г. Т. Р. Насибуллин1, Р. И. Садикова1, Я. Р. Тимашева1, И. А. Туктарова1, В. В. Эрдман1, Л. Н. Хусаинова2, И. Е. Николаева3, О. Е. Мустафина1
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа 450054
e-mail: NasibullinTR@yandex.ru 2Клиника Башкирского государственного медицинского университета, Уфа 450059 3Республиканский кардиологический диспансер, Уфа 450106 Поступила в редакцию 15.02.2013 г.
Изучены распределения частот генотипов и аллелей по полиморфным маркерам rs2076059 (3832T > C) гена SELE, rs6131 (S290N) гена SELP, rs1131498 (F206L) гена SELL, rs5498 (K469E) гена ICAM1, rs35569394 (-2549(18)1/D) гена VEGFA, rs1024611 (-2518A>G) гена CCL2 в группе больных (280 человек), перенесших инфаркт миокарда (ИМ), и контрольной группе (312 человек). C помощью метода Монте-Карло и цепи Маркова (APSampler) выявлены сочетания аллелей, ассоциированные как с пониженным, так и с повышенным риском ИМ. Из них наиболее значимыми оказались SELE*C + + SELP*S + CCL2*A (FDR = 0.0005, OR = 0.42), SELP*S + CCL2*A (FDR = 0.0009, OR = 0.36), SELL*F+ + VEGFA*I + CCL2*G/G (FDR = 0.0009, OR = 4.17), VEGFA*I + CCL2*G/G (FDR = 0.0009, OR = 3.76) SELE*C + CCL2*A (FDR = 0.0023, OR = 0.47) и SELL*F + CCL2*G/G (FDR = 0.003, OR = 3.15).
DOI: 10.7868/S0016675814020118
Инфаркт миокарда (ИМ) — один из наиболее тяжелых клинических вариантов ишемической болезни сердца (ИБС), в основе которого лежит некроз сердечной мышцы, развивающийся в результате острой недостаточности коронарного кровообращения. ИМ является наиболее частой причиной смертности и инвалидизации населения как в нашей стране, так и за рубежом. На сегодня обнаружены основные внешнесредовые факторы риска развития ИБС, но по-прежнему не до конца изучены генетические аспекты развития заболевания, тогда как именно они определяют индивидуальную восприимчивость к неблагоприятным внешнесредовым факторам и могут быть основой эффективной первичной и вторичной профилактики патологии.
В подавляющем большинстве случаев ИБС представляет собой полигенное заболевание, обусловленное сложным взаимодействием факторов внешней среды и генетическими факторами. Следует также отметить, что во многих случаях наблюдается нелинейное взаимодействие факторов, что делает малоинформативным изучение отдельных элементов. При этом анализ сочетаний множества факторов ограничивается возможностями статистического анализа. Один из подходов к решению данной проблемы — анализ сочетаний полиморфных ДНК-маркеров генов, продукты экспрессии которых задействованы в патогенезе заболевания и находятся в тесной функциональной взаимосвязи.
Ключевым этапом патогенеза ИБС в целом, и ИМ в частности, является атеросклеротическое повреждение коронарных сосудов, в развитии которого важную роль играют локальное и системное воспаления [1, 2]. Начальный этап развития этого процесса — адгезия лейкоцитов к поврежденной сосудистой стенке и их миграция из сосудистого русла в формирующийся очаг воспаления. В связи с этим среди множества генов-кандидатов ИМ можно выделить гены, контролирующие синтез молекул адгезии, хемокинов и факторов роста сосудов.
Молекулы межклеточной адгезии представляют собой связанные с плазматической мембраной белки, обеспечивающие высокоспецифичное взаимодействие между сосудистой стенкой и клетками крови. К многочисленному семейству данных молекул относятся селектины (L, E, P) и молекула межклеточной адгезии первого типа (ICAM1).
Селектины — лектиновые трансмембранные белки, опосредующие самую раннюю стадию взаимодействия лейкоцитов и сосудистой стенки. L-селектин (SELL) постоянно экспрессируется на поверхности мембран лейкоцитов. Е-селектин (SELE) и P-селектин (SELP) появляются на поверхности мембран эндотелиальных клеток под влиянием цитокинов (TNF, IL1) [3]. SELP также выявляется на мембранах тромбоцитов, обеспечивая их взаимодействие с лейкоцитами.
ICAM1 относится к суперсемейству иммуноглобулинов, является лигандом для интегрино-
вых комплексов LFA-1 (CD11a/CD18) и Mac-1 (CD11b/CD18), которые расположены на ней-трофилах и моноцитах. Полагают, что ICAM1 постоянно экспрессируется в эндотелиальных клетках сосудов и значительно усиливается при его стимуляции провоспалительными цитокинами и модифицированными липопротеинами [4].
Другой группой медиаторов воспаления являются хемокины, основная функция которых состоит в обеспечении клеточной миграции. Представитель данной группы — CCL2 (моноцитар-ный хемоаттрактантный протеин-1 или MCP1), который проявляет наиболее сильную хемотакси-ческую активность по отношению к Т-лимфоци-там и моноцитам, способствует их активации и прилипанию к сосудистой стенке [5]; предполагают, что именно CCL2 играет главную роль в инфильтрации моноцитов в артериальную стенку при развитии атеросклеротической бляшки [6].
Сосудистый эндотелиальный фактор роста, или сосудистый фактор проницаемости (VEGF/VFP), является одним из ключевых регуляторов ангиогенеза. VEGF действует селективно на сосудистый эндотелий, увеличивая его проницаемость, а также индуцирует клеточную миграцию и деление. Исследования влияния VEGF на проницаемость эндотелиальных клеток аорты in vitro показали, что в присутствии VEGF значительно увеличивается проницаемость эндотели-ального слоя по отношению к липопротедлипазе [7], что является одним из инициирующих факторов атеросклероза. Кроме того, предполагают, что VEGF может способствовать миграции макрофагов — одному из критических событий атероскле-ротического поражения сосудов [8]. Согласно результатам проспективного исследования (PHHP — Pawtucket Heart Health Program) повышенный уровень VEGFA в плазме крови является независимым фактором риска смерти от ИБС [9].
Цель исследования — изучение полиморфных маркеров rs2076059 (3832T>C ген SELE), rs6131 (S290N ген SELP), rs1131498 (F206L ген SELL), rs5498 (K469E ген ICAM1), rs35569394 (-2549(18)1/D ген VEGFA), rs1024611 (-2518A>Gген CCL2) как потенциальных предикторов ИМ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследований стали образцы ДНК, выделенные из 5—6 мл цельной венозной крови больных (280 человек), перенесших ИМ в возрасте до 55 лет (средний возраст ± стандартное отклонение, 44.39 ± 5.63). Диагноз ИМ устанавливался на базе Республиканского кардиологического диспансера (г. Уфа). Группу сравнения (312 человек) составили мужчины (татары по этнической принадлежности) в возрасте от 30 до 60 лет (42.54 ±
± 6.69) без клинических признаков сердечно-сосудистых заболеваний.
ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [10]. Генотипирование проводили с использованием полимеразной цепной реакции и последующей обработки продуктов амплификации соответствующей рестриктазой. Разделение полученных ампликонов проводили с помощью электрофореза в 7%-ном полиакриламидном или 2%-ном агарозном гелях. Праймеры и ре-стриктазы, специфичные для каждого маркера, отбирались с помощью пакета программ DNA Star 5.05 и баз данных http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp. Последовательности праймеров, использованные рестриктазы, размеры полученных фрагментов представлены в табл. 1.
Для сравнения групп по частотам генотипов и аллелей использовался точный двухсторонний тест Фишера. При анализе отклонения наблюдаемых частот генотипов от теоретически ожидаемого равновесного распределения Харди-Вайн-берга использовалась программа Arlequn 3.0. При анализе ассоциаций сочетаний аллелей/генотипов с ИМ применялась программа APSampler 3.6.0. Программа и ее описание представлены на сайте https://code.google.eom/p/apsampler, основной алгоритм описан в работе [11]. Выявленные различия считались статистически значимыми при значении FDR менее 0.05 (FDR — False Discovery Rate).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты анализа распределений частот генотипов и аллелей по изученным полиморфным маркерам представлены в табл. 2. В контрольной группе наблюдаемые распределения частот генотипов соответствовали теоретически ожидаемому распределению Харди-Вайнберга. Следует отметить, что в группе больных в отличие от контрольной группы значительно снижены частоты генотипов ICAM1*K/K (P = 0.008), CCL2*A/A (P = = 0.017) и повышены частоты генотипов SELE*T/T (P = 0.025), SELP*N/N (P = 0.015), CLL2*G/G (P = 0.0001).
С помощью алгоритма APSampler нами проведен поиск сочетаний аллелей, значимо ассоциированных с ИМ (табл. 3). Из выявленных сочетаний, ассоциированных с ИМ с повышенным риском, ассоциированы: SELL*F + VEGFA*I + + CCL2*G/G (OR = 4.17), VEGFA*I + CCL2*G/G (OR = 3.76), SELL*F + CCL2*G/G (OR = 3.15), SELP*N/N + CCL2*G (OR = 3.08), ICAM1*E + + CCL2*G (OR = 1.91) и SELL*F + ICAM1*E (OR = = 1.66). Следующие варианты могут рассматриваться в качестве протективных — SELP*S + + CCL2*A (OR = 0.36), SELE*C + SELP*S + + CCL2*A (OR = 0.42), SELE*C + CCL2*A (OR =
238
НАСИБУЛЛИН и др.
Таблица 1. Перечень генов, последовательности праймеров и номенклатура аллелей анализируемых полиморфных маркеров
Ген (OMIM), хромосомная локализация Полиморфизм Праймеры (рестриктаза) Аллели (размер фрагментов, пн)
SELE (131210) 1q24.2 3832С>Т rs2076059 F 5'-gtc aca gca tca cac tca a-3' R 5'-gtc ata act cct aat ctg g-3' (Hinfl) *T (185, 126) *C (311)
SELP (173610) 1q24.2 S290N rs6131 F 5'-gtc caa gcc cct cac tct-3' R 5'-ccc tgg gaa ctg gta atc-3' (ÄseNI) *S (179, 105, 12) *N (284, 12)
SELL (153240) 1q24.2 F206L rs1131498 F 5'-tta cct aag aag aag caa aga-3' R 5'-atg gag aat gtg tag aaa tca-3' (AluI) *L (41, 74) *F (115)
LCAM1 (147840) 19p13.2 K469E rs5498 F 5'-tgc ccg agc tca agt gtc-3' R 5'-gcc tgc agt gcc cat tat-3' (&M236I) *K (301) *E (127, 174)
VEGF1 (192240) 6p21.1 —2549(18)L/D rs35569394 F 5'-gtg ctg agg atg ggg ctg ac-3' R 5'-caa agt tgg ggc tct ga-3' *L(196) *D (178)
CCL2 (601960)17q12 -2518A>G rs1024611 F 5'-cag cgg ggg agg gca tct-3' R 5'-aca ggg aag gtg aag ggt at-3' PvuII *A (105) *G (51, 54)
= 0.47), SELP*S + ICAM1*K (OR = 0.59). В целом по результатам анализа с помощью программы APSample
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.