МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 2, с. 268-274
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 576.85.851
АССОЦИАЦИЯ БАКТЕРИЙ, УТИЛИЗИРУЮЩАЯ ЦЕЛЛЮЛОЗУ
© 2009 г. В. А. Думова, Ю. В. Круглов
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии
Россельхозакадемии, Пушкин, Санкт-Петербург Поступила в редакцию: 28.01.2008 г.
На основании фенотипических и филогенетических признаков описана структура ассоциации бактерий, утилизирующая целлюлозу. Выделенные из ассоциации бактерии по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам идентифицированы как Sporocytophaga sp., Xanthomonas sp. и Pseudomonas sp. Согласно результатам филогенетического анализа, основанного на сравнении нуклеотидных последовательностей ПЦР фрагментов гена 16S рРНК, выделенных из ассоциации, выявлено 6 видов бактерий, относящихся к филогенетическим кластерам Alcaligenes sp., Ochrobacterium sp., Sphingomonas sp., Achromobacter sp., Pseudomonas sp. и Flexibacteraceae (Sporocytophaga).
Ключевые слова: ассоциация бактерий, целлюлоза, Sporocytophaga sp.
Целлюлоза составляет в среднем 30-50% растительной массы и является основным источником углерода, поступающим в почву с растительными остатками [1, 2].
В природных условиях разложение целлюлозы происходит только в результате жизнедеятельности бактерий, актиномицетов и грибов, продуцирующих комплекс гидролитических ферментов - цел-люлаз. Этот процесс представляет важную часть биосферного цикла углерода.
Гены целлюлаз подвержены катаболитной репрессии и синтез этих ферментов прекращается при накоплении в окружающей среде достаточного количества продукта гидролиза целлюлозы - глюкозы [2]. Соответственно, прекращается разложение целлюлозы.
В почве и других природных средах целлюлозо-разлагающие бактерии существуют в окружении других микроорганизмов, которые используют продукты гидролиза целлюлозы - целлобиозу и глюкозу - в качестве источника углерода и энергетического материала [3-5]. В результате снимается катабо-литная репрессия генов целлюлаз и происходит дальнейшее разложение целлюлозы за счет вновь синтезированных ферментов и нарастающей массы бактерий целлюлозолитиков. По мнению ряда авторов, целлюлозоразлагающие микроорганизмы играют ключевую роль в формировании микробного комплекса почвы [6]. Хорошо известно, насколько трудно отделить целлюлозоразлагающие бактерии от сопутствующей микрофлоры, что дало повод уже на ранних этапах изучения этого вопроса говорить о своеобразном симбиозе между ними [3, 7]. Тем не
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: kruglov@arriam. spb.ru).
менее, исследования в этой области крайне немногочисленны. Показано, что эффективность разложения целлюлозы в чистой культуре Cellulomonas flavi-gena ниже, чем в смешанной культуре [4]. В ряде работ отмечается, что в ассоциациях между целлюло-зоразлагающими бактериями и сопутствующими микроорганизмами происходит обмен ростовыми факторами, что обеспечивает их рост и более интенсивное разложение целлюлозы [3]. Имшенецкий и другие авторы наблюдали размножение Azotobacter sp. и фиксацию молекулярного азота в смешанной культуре бактерий, утилизирущей целлюлозу [7]. Аналогично, отмечали рост и фиксацию молекулярного азота в смешанных культурах азоспирил и цел-люлозоразлагающих бактерий [8].
Подобные результаты приводят к заключению, что взаимодействие целлюлозолитических бактерий в ассоциации с другими микроорганизмами имеет многоплановый и многофункциональный характер.
Среди микроорганизмов, изолированных из накопительной культуры аэробных целлюлозоразла-гающих микроорганизмов, встречаются грамотри-цательные бактерии, относящиеся к родам Xantho-monas, Pseudomonas, Alcaligenes, Aerobacter, а также грамположительные бактерии рода Micrococcus [4, 9, 10]. Однако имеющиеся в литературе данные не позволяют судить ни о стабильности таких ассоциаций, ни о специфичности их состава, приуроченном к определенным видам целлюлозоразлагающих бактерий.
Цель настоящей работы - изучить структуру ассоциации микроорганизмов, утилизирующих целлюлозу, сформировавшуюся в накопительной культуре Sporocytophaga sp.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение и поддержание ассоциации микроорганизмов, утилизирующей целлюлозу. Ассоциация микроорганизмов, утилизирущая целлюлозу была выделена из торфо-соломистого субстрата, полученного путем компостирования торфа с соломой. Выделение проводили методом посева из разведений исходной суспензии торфо-соломенного субстрата на агаризованную питательную среду Гетчинсона, г/л: K2HPO4 ■ 3Н20 - 1.0; CaCl2 ■ 2Н20 - 0.01; MgSO4 ■ 7Н20 - 0.2; NaCl - 0.1; FeCl3 ■ 6Н20 - 0.01; КаК03 - 2.5; агар-агар - 20 (рН 7.2-7.3) с целлюлозным фильтром ("Экрос" синяя лента). Микроорганизмы культивировали в термостате при 26°С. Ассоциации микроорганизмов, утилизирующих целлюлозу, выявляли на 7-е сут по появлению зон просветления (разложения целлюлозы) на бумажном фильтре. Из зоны, характеризующейся наиболее интенсивным разложением целлюлозы и темно-желтым пигментом, целлюлозоразлагающие бактерии пересевали на свежую агаризованную питательную среду того же состава и культивировали в тех же условиях.
Ассоциация микроорганизмов, выделенная нами, полностью разлагала бумажный фильтр в течение месяца и поддерживалась в течение года путем ежемесячного пересева на свежую питательную среду Гетчинсона с фильтровальной бумагой.
Стабильность ассоциации оценивали по сохранению качественного и количественного состава гетеротрофных бактерий спустя год, после двух последовательных пассажей. С этой целью бактерии со среды Гетчинсона пересевали на глюкозопеп-тонный агар (г/л: глюкоза - 1.0; пептон ("Serva") -1.0; дрожжевой экстракт - 1.0; K2HP04 ■ 3Н20 - 1.0; агар-агар - 20) и культивировали при температуре 26°С. Учет бактериального разнообразия гетеро-трофов проводили на 5 сут.
0дновременно с описанием и подсчетом морфологических типов гетеротрофов проводили выделение отдельных представителей ассоциации общепринятым методом.
Для оценки бактерий, способных к росту на целлюлозе, все выделенные изоляты высевали на поверхность плотной питательной среды Гетчинсона с бумажным фильтром и культивировали в термостате при температуре 26°С в течение месяца.
Среди изолятов, выделенных из ассоциации, только один обладал способностью разлагать целлюлозу. Контрольные посевы и микроскопирова-ние изолята показали, что он представлен смешанной культурой, в которую входит целлюлозоразла-гающая бактерия рода Sporocytophaga. Попытки их разделить не привели к положительному результату. Поскольку Sporocytophaga sp. устойчива к высоким температурам, для ее выделения в чистую культуру был использован метод пастеризации и после-
дующее микробиологическое клонирование на минеральной среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой. Чистота культуры проверялась методом посева на глюкозопептонный агар, среду Гетчинсона и прямым микроскопированием.
После разделения ассоциации на изоляты, проводили идентификацию бактерий по морфолого-куль-туральным и физиолого-биохимическим признакам.
Определение состава целлюлозолитической ассоциации по гену 16S рРНК. Тотальную ДНК ассоциации выделяли на протяжении двух последовательных пассажей [11]. Результаты каждого пассажа анализировали отдельно. С этой целью культуру ассоциации целлюлозоразлагающих бактерий лизировали в буфере (0.2 М NaOH, 1% SDS (додецилсульфат Na). Полученный лизат прогревали 5 мин при 95°С и проводили полиме-разную цепную реакцию (ПЦР). Для проведения ПЦР использовали праймеры для амплификации гена 16S рРНК FBD1/RBD1 прямой праймер (fBD1): 5'-HAATHYGTGCCAGCAGC-3'; обратный праймер (rBD1): 5'-GTCRTCCYDCCTCCTC-3'), сконструированные в 2005 г. [12].
ПЦР продукты ассоциации клонировали в векторе pTZ57R ("Fermentas"). Для этого проводили реакцию лигирования амплифицированных ДНК фрагментов с вектором и трансформацию полученными конструкциями клеток E. coli штамма DH10B. Скрининг трансформантов проводили с помощью метода бело-голубой селекции. Колонии белого цвета, предположительно содержащие вставку ПЦР продукта, анализировали с помощью проведения ПЦР с праймерами М13 ("Fermentas") к последовательностям дНк фага М13, фланкирующим вставку.
Для идентификации индивидуальных клонов проводили рестрикционный анализ. С этой целью 5 мкл полученных ранее ПЦР-фрагментов добавляли к 5 мкл реакционной смеси, включающей рестрикционный буфер ("Fermentas") и эндонуклеазу рестрикции Haehl ("Sigma") (2 ед./мкл), и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Результаты реакции рестрикции визуализировали, проводя электрофорез в 4% ага-розном геле.
Определив индивидуальные клоны, содержащие в себе различающиеся гены 16S рРНК ассоциации, проводили секвенирование выделенных генов. Для этого выделяли и очищали плазмидную ДНК следующим образом: 24-часовую культуру трансформированных клеток E. coli, выращенную при 37°С, помещали в 1.5-мл. микропробирки и осаждали, центрифугируя при 18000 g 1-2 мин, промывая водой. Полученный осадок ресуспенди-ровали в 200 мкл буферного раствора 1 (50 мМ mpuc-HCl (pH 7.8), 10 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл РНКазы A ("Fluka"), встряхивая до гомогенного состояния.
К полученной суспензии добавляли 200 мкл раствора 2 (0.2 М NaOH, 1% SDS), плавно перемешива-
Таблица 1. Характеристика бактерий в ассоциации
Морфотип Окраска по Граму Тест Хью-Лейфсона Оксидаза Каталаза Гидролиз целлюлозы Наименование бактерий
01 - О* + + + Sporocytophaga sp. + неизвестные виды
02 - О - + - Xanthomonas sp.
03 - Не определен + + - Утерян
04 - О + + - Pseudomonas sp.
* О - аэробный тип метаболизма.
ли и инкубировали 3-5 мин при комнатной температуре до просветления раствора. Хромосомную ДНК осаждали, добавляя к полученному лизату раствор 3 (1.32 М СН3СООК, рН 4.8), плавно перемешивали, выдерживали 5 мин при -20°С и осаждали центрифугированием при 18000 g 15 мин при 4°С.
Для очистки плазмидной ДНК использовали метод гидрофобной хроматографии. Шприцы на 2 мл вставляли в миниколонки и подсоединяли к вакуумному насосу. В шприцы переносили супернатант, добавляли 1 мл смолы ("Promega") и осаждали плаз-мидную ДНК вместе со смолой под
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.