МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 1, с. 190-192
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.1:616.6
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА DAZ T > C C РИСКОМ ИДИОПАТИЧЕСКОГО МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ В СЕВЕРНОМ ИРАНЕ#
© 2015 г. S. P. Hadiyan, F. Mashayekhi*, Z. Salehi
Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran Поступила в редакцию 03.05.2014 г. Принята к печати 24.06.2014 г.
Ключевые слова: DAZ, полиморфизм, идиопатическое мужское бесплодие.
THE ASSOCIATION BETWEEN DAZ T > C POLYMORPHISM AND IDIOPATHIC MALE INFERTILITY RISK IN NORTH OF IRAN, by S. P. Hadiyan, F. Mashayekhi*, Z. Salehi (Department of Biology, Faculty of sciences, University of Guilan, Rasht, Iran; *e-mail: umistbiology@yahoo.co.uk).
Keywords: DAZ, polymorphism, idiopathic male infertility.
DOI: 10.7868/S0026898415010048
Делеции гена фактора азооспермии с (AZFc) часто обнаруживаются при мужском бесплодии. Расчетная частота делеций AZFc составляет примерно 1 : 4000 мужчин, что соответствует ~ 12% случаев необструктивной азооспермии и около 6% случаев тяжелой олигозооспермии [1]. Ген, делетируе-мый при азооспермии (DAZ), был одним из первых факторов азооспермии, выделенных из области AZF, локализованной на хромосоме Y человека. DAZ имеет два аутосомных паралога, DAZL и BOULE, представленых одной копией в геномах всех позвоночных и некоторых низших организмов [2]. Полагают, что гены DAZ, которые экспрессируются на всех стадиях развития терминальных клеток, выполняют различные функции в ходе сперматогенеза — регулируют трансляцию, кодируют специфичные для герминальных клеток РНК-связы-вающие белки [3], участвуют в контроле мейоза и поддержании популяции примордиальных гер-минальных клеток.
Обнаружено, что гены DAZ полиморфны как по числу копий, так и по содержанию повторов DAZ. Делеция gr/gr (gr = green-red) может привести к элиминации DAZ1/2 или DAZ3/4 в зависимости от локализации сайта рекомбинации в повторах субампликона gr, причем делеция DAZ1/2 наиболее вероятна в том случае, когда отсутствуют горячие точки рекомбинации [4]. Этиология приблизительно 30—50% всех случаев азооспер-
мии или тяжелой олигозооспермии неизвестна, поэтому их относят к идиопатическим [5]. Полиморфизмы, в отличие от мутаций, не связаны непосредственно с определенными заболеваниями. Однако они служат удобными инструментами для изучения многофакторных болезней.
В представленной работе изучена возможность ассоциации полиморфизма T > C в интроне 3 DAZ с идиопатическим мужским бесплодием в Северном Иране.
Клинические образцы. Мы обследовали 110 мужчин в возрасте от 26 до 42 лет с идиопатическим бесплодием и 200 здоровых мужчин. Все мужчины из контрольной группы имели не меньше двух детей, рожденных без использования вспомогательных репродуктивных технологий. Исследование было санкционировано местным лицензионным комитетом, оно проводилось в соответствии с принципами Хельсинской декларации 1975 года в редакции 1983 года. От всех участников было получено информированное согласие.
Экстракция геномной ДНК и генотипирование.
Геномную ДНК экстрагировали из периферической крови с использованием набора DNG plus ("Cinnagen", Иран). Для амплификации гена DAZ использовали праймеры, описанные Agulnik и со-авт. [6]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в приборе Bio Rad thermocycler (Bio
Принятые сокращения: AZF — фактор азооспермии Azoospermia factor), DAZ — делетируемый при азооспермии (Deleted in Azoospermia).
# Статья представлена на английском языке.
* Эл. почта: umistbiology@yahoo.co.uk
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА DAZ T > C C РИСКОМ
191
12345678
Определение полиморфизма гена DAZ с использованием ПЦР—ПДРФ и рестриктазы МЬо1. 1 — Маркеры размера ДНК; 2, 3 — гомозиготные генотипы СС (полосы 193 п.н.); 4—6 — гетерозиготные генотипы (полосы 193/132/61 п.н.); 7, 8 — гомозиготные генотипы ТТ (полосы 132/61 п.н.).
Rad", США). Для ПЦР-амплификации геномного фрагмента размером 193 п.н. использовали праймеры 5' - GATCTGCTGTACACTTAGCA- 3' и 5'-CTATCTTCTGGACATCCAC -3'.
Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) во фрагменте гена DAZ выявляли с использованием рестриктазы MboI ("Fermentas International Inc".). Aмплифицированную ДНК (1 мкл реакционной смеси ПЦР) расщепляли 10 ед. MboI в течение ночи. Рестрикционные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 3%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Расщепление ампликона дикого типа (MboI+) давало два фрагмента размером 132 и 61 п.н. (аллель T). При удалении сайта рестрикции MboI (MboI-) в результате точечной мутации (аллель С) образуется один фрагмент ДНК размером 193 п.н.
Статистический анализ. Различия в частотах аллелей в опытной и контрольной группах определяли с использованием теста х2 с одной степенью свободы для анализа распределения аллелей и генотипов. Ассоциации считали статистически значимыми при Р < 0.05.
Не выявлено существенных различий в возрастном распределении между группами случай и контроль (P = 0.13). На рисунке представлены все возможные генотипы гена DAZ. Распределение генотипов и аллелей полиморфизма T > C DAZ в группах случай и контроль суммировано в табли-
це. Частоты генотипов СС, СТ и ТТ в группе мужчин с бесплодием составили 1.8, 87.2 и 11% соответственно против 1, 92 и 7% в контрольной группе (таблица). Не выявлено значимых различий в частотах генотипов полиморфизма Т > С DAZ в группах мужчин с бесплодием и в контрольной группе. Частота аллеля С в группах случай и контроль составила 0.454 и 0.47 соответственно (Р > 0.05).
Накапливаются данные в пользу возможной ассоциации полиморфизмов нескольких генов, включая МТИЕЯ, ЕЯ-а, ЕЯ-в и СУРЫ, с мужским бесплодием [7—9]. Полиморфизмы в отличие от мутаций не связаны непосредственно с определенными заболеваниями. В настоящей работе, выполненной методом случай—контроль, изучена возможность ассоциации полиморфизма Т > С DAZ с риском идиопатического мужского бесплодия. Наши результаты указывают на отсутствие статистически значимых различий в распределении аллелей в группах случай и контроль.
Насколько нам известно, в нашей работе впервые проверена возможность ассоциации этого полиморфизма гена DAZ с бесплодием у иранских мужчин. Делеции генов DAZ могут приводить к различным фенотипам — от олигозооспермии до азооспермии [5]. Кроме того, у больных азооспермией снижена экспрессия гена DAZ [10], а частичные делеции этого гена связаны, по-видимому, с олигозооспермией [11]. С помощью Сау-зерн-блотинга проанализировали гены DAZ у
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма DAZ у 110 мужчин с идиопатическим бесплодием и у 200 здоровых индивидов
Частоты генотипов и аллелей Вариант DAZ Здоровые мужчины (n = 200) Бесплодные мужчины (n =110) Р
Генотип, % (n) СС* 1.0 (2) 1.8 (2) 1
СТ 92.0 (184) 87.2 (96) 0.52NS
ТТ 7.0(14) 11.0 (12) 0.85NS
Аллель СТ 0.47 0.454 NS
T 0.53 0.545
* — Контрольная группа. NS — незначимые различия.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ том 49 № 1 2015
192
HADIYAN и др.
82 мужчин и выявили существование полиморфизма этих генов [4] .
Было также определено соотношение повторяющихся последовательностей MboI+ и MboI- у 32 мужчин из двух популяций — бурят из Монголии и майя из Юкатана [12]. Оказалось, что соотношение ампликонов дикого типа и мутантного варьирует у разных индивидов от 0 до 100%.
Результаты нашей работы указывают на отсутствие значимой ассоциации полиморфизма T > C гена DAZ с бесплодием у мужчин из Северного Ирана. Дальнейшее изучение на выборках большого размера позволит установить роль этого полиморфизма гена DAZ в идиопатическом мужском бесплодии.
Мы благодарны всем донорам образцов, которые сделали возможной проведение этой работы.
Эта работа получила частичную поддержку гранта Университета Guilan.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kuroda-Kawaguchi T., Skaletsky H., Brown L.G., Minx P.J., Cordum H.S., Waterston R.H., Wilson R.K., Silber S., Oates R., Rozen S., Page D.C. 2001. The AZFc region of the Y chromosome features massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men. Nat. Genet. 29, 279-286.
2. Cooke H.J., Lee, M., Kerr S., Ruggiu M. 1996. A mu-rine homologue of the human DAZ gene is autosomal and expressed only in male and female gonads. Hum. Mol. Genet. 5, 513-516.
3. Yen H.W., Jakimiuk A.J., Munir I., Magoffin D.A. 2004. Selective alterations in insulin receptor sub-strates-1, -2 and -4 in theca but not granulosa cells from polycystic ovaries. Mol. Hum. Reprod. 10, 473-479.
4. Lin YW., Thi D.A., Kuo P.L., Hsu C.C., Huang B.D., Yu Y.H., Vogt P.H., Krause W., Ferlin A., Foresta C., Bienvenu T., Schempp W., Yen P.H. 2005. Polymorphisms associated with the DAZ genes on the human Ychromosome. Genomics. 86, 431—438.
5. Krausz C., Forti G. 2000. Clinical aspects of male infertility. Results. Probl. Cell. Differ. 28, 1-21.
6. Agulnik A.I., Zharkikh A., Boettger-Tong H., Bourg-eron T., McElreavey K., Bishop C.E. 1998. Evolution of the DAZ gene family suggests that Y-linked DAZ plays little, or a limited, role in spermatogenesis but underlines a recent African origin for human populations. Hum. Mol. Genet. 7, 1371-1377.
7. Safarinejad M.R., Shafiei N., Safarinejad S. 2011. Relationship between genetic polymorphisms of methyle-netetrahydrofolate reductase (C677T, A1298C, and G1793A) as risk factors for idiopathic male infertility. Reprod. Sci. 18, 304-315.
8. Su M.T., Chen C.H., Kuo P.H., Hsu C.C., Lee I.W., Pan H.A., Chen Y.T., Kuo P.L. 2010. Polymorphisms of estrogen-related genes jointly confer susceptibility to human spermatogenic defect. Fertil. Steril. 93, 141-149.
9. Aydos S.E., Taspinar M., Sunguroglu A., Aydos K. 2009. Association of CYP1A1 and glutathione S-trans-ferase polymorphisms with male factor infertility. Fertil. Steril. 92, 541-547.
10. Lavery R., Glennon M., Houghton J., Nolan A., Egan D., Maher M. 2007. Investigation of DAZ and RBMY1 gene expression in human testis by quantitative real-time PCR. Arch. Androl. 53, 71-73.
11. Writzl K., Zorn B., Peterlin B. 2005. Copy number of DAZ genes in infertile men. Fertil. Steril. 84, 15221525.
12. Ruiz L.M., Szmu
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.