ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 2, с. 230-235
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА ^
УДК 618.145-007.415:575
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ MMP3 и MMP9 С РАЗВИТИЕМ ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА
© 2014 г. М. И. Ярмолинская, А. С. Молотков, В. Ф. Беженарь, Н. Ю. Швед, Т. Э. Иващенко, В. С. Баранов
Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург 199034
e-mail: m.yarmolinskaya@gmail.com Поступила в редакцию 03.04.2013 г.
Представлены результаты анализа полиморфизма генов семейства матриксных металлопротеиназ (MMPs): MMP3 (rs3025058), MMP7 (rsl 1568818), MMP9 (rs17576, rs2250889), MMP12 (rs2276109), MMP13 (rs2252070) у больных наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) и в группе здоровых женщин. Выявлены достоверные различия в распределении частот генотипов ряда полиморфных сайтов генов MMP3 и MMP9. С помощью метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) определены 14 сочетанных генотипов по генам MMPs: MMP3 (rs3025058) х MMP7 (rs11568818) х MMP9 (rs17576), увеличивающих риск развития заболевания, и 10 сочетанных генотипов пониженного риска. Установлены две статистически значимые модели, характеризующиеся 100%-ной воспроизводимостью и точностью 83 и 78%.
DOI: 10.7868/S0016675814010123
Среди многочисленных концепций развития наружного генитального эндометриоза (НГЭ) наиболее широкое распространение получила теория ретроградной менструации, предложенная J. Sampson в 1927 г., согласно которой заболевание развивается вследствие имплантации и роста эндометриальной ткани, которая попадает в брюшную полость через маточные трубы. До сих пор неясно, почему нередко заброшенный при менструации эндометрий получает возможность к инвазии брюшины и формированию очагов ин-вазивного роста (гетеротопий).
Наследственная предрасположенность к НГЭ не вызывает сомнения. Об этом, в частности, свидетельствуют повышенная частота заболевания у близких родственников пациентов и конкордант-ность по НГЭ у монозиготных близнецов [1]. Имеются наблюдения, согласно которым наследование при семейном генитальном эндометри-озе не происходит согласно законам Менделя и скорее имеет полигенный (мультифакторный) характер [2].
Генная сеть НГЭ очень сложная и включает различные, функционально тесно взаимосвязанные гены метаболизма (детоксикации), межклеточных взаимодействий, проонкогены, гены, ответственные за эндокринные функции и иммунный статус [3, 4].
Важную роль в патогенезе НГЭ могут играть матриксные металлопротеиназы (Matrix Metallo-
Proteinase, MMPs ) — семейство внеклеточных, цинк-содержащих протеиназ, которые обладают способностью специфически гидролизовать основные белки внеклеточного матрикса и играют активную роль в регуляции выработки биологически активных молекул, таких как цитокины, факторы роста и др., стимулирующие процессы неоангиогенеза [5]. Известно, что наследственные вариации (полиморфизмы) в генах металлопроте-иназ могут приводить к изменениям их транскрипции и экспрессии и таким образом изменять активность соответствующих ферментов [6].
В литературе описано повышение активности MMP1, -2, -3, -7, -9, -10 в эндометриоидных гете-ротопиях и в биологических жидкостях (крови, перитонеальной жидкости, моче) у больных НГЭ, причем уровень активности ферментов возрастает с увеличением тяжести и распространенности заболевания [7—11].
Цель данной работы — проанализировать ассоциацию некоторых полиморфных сайтов генов ряда металлопротеиназ с развитием НГЭ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика групп. Обследованы две группы пациенток. В основную группу вошли 78 больных с НГЭ, установленным при проведении лапароскопии и подтвержденным результатами гистологического исследования. В группу контроля были включены 45 женщин без НГЭ и других ги-
Таблица 1. Полиморфные сайты и использованные олигопраймеры
Ген Полиморфизм Структура
MMP3 rs3025058 (5G/6G) MMP3 F TTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGA MMP3 R TTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT
MMP7 rs11568818 (-181A/G) MMP7 F TGGTACCATAATGTCCTGAATG MMP7 R TCGTTATTGGCAGGAAGCACACAATGAATT
MMP9 rs17576 (R279Q) rs2250889 (P574R) MMP9 R279Q F CGCCCCAGGACTCTACACGC MMP9 R279Q R CGGGGCCATTGGAAGTCAGG MMP9 P574R R CTGGACTCGGTCTTTGAGGCG MMP9 P574R F AGCCGCCCCTACGTTTGCTAA
MMP12 rs2276109 (-82A/G) MMP12 F GATAGGTGGACGTAGAGGCTTATT MMP12 R CATTGTAAACTTCTAAACGGATCA
MMP13 rs2252070 (-77A/G) MMP13 F AACATGCCATCTTGATACACTTA MMP13 R TTATGGATAGGTTTCCACTTCA
некологических заболеваний, что доказывалось отсутствием у них эндометриоидных гетеротопий при лапароскопии. Редкость показаний для дифференциальной диагностической лапароскопии при отсутствии явных клинических признаков НГЭ явилась серьезным препятствием при формировании представительной по численности контрольной группы в данном исследовании.
Все пациенты основной группы и группы контроля относились к популяции Северо-Западного региона РФ и по своему этническому происхождению принадлежали к славянам. В исследуемые группы не включались пациентки с тяжелыми хроническими соматическими заболеваниями (бронхиальная астма, сахарный диабет, аутоиммунные заболевания и т.д.).
Методы исследования. Работа выполнена на образцах ДНК, выделенной из лейкоцитов крови. Методом ПЦР-ПДРФ анализа изучены аллель-ные варианты генов MMP3 (rs3025058), MMP7 (rs11568818), MMP9 (rs17576, rs2250889), MMP12 (rs2276109), MMP13 (rs2252070).
Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили в соответствии с методикой Сэмбрука (1989) с некоторыми модификациями.
Характеристики изученных аллельных вариантов генов MMPs и последовательности использованных олигопраймеров представлены в табл. 1.
Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 16.6 мМ сульфата аммония, 6.7 мМ MgCl2, 6.7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1.0 мМ каждого dNTP и 1 U Taq-ДНК-полимеразы ("Бион", Москва).
Для проведения ПЦР использовали следующие условия ПЦР: после денатурации (94°С,
7 мин) проводили 30 циклов амплификации в режиме: 94°С - 40 с; 56°С - 40 с; 72°С - 1 мин. После амплификации продукты реакции анализировали в 7.5%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в УФ-свете.
Гидролиз амплифицированных фрагментов ДНК проводили согласно рекомендациям фирм-изготовителей ("Сибэнзим", Новосибирск).
ПЦР-продукты гидролизировали эндонукле-азами рестрикции (табл. 2) при 37°С в течение 16 ч в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл амплификата, 8.5 мкл воды, 1.5 мкл 10-кратного буфера (рекомендованного производителем для каждой рестриктазы) и 5-10 ед. (0.25-1.0 мкл) ре-стриктазы.
Гели окрашивали водным раствором бромистого этидия (0.5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе "Macrovue" ("Pharmacia LKB", Великобритания), фотографировали с помощью системы видео-гель-документации ("Vilber Lourmat").
Статистическую обработку результатов проводили методом хи-квардрат (х2) с учетом поправки Йетса для парных сравнений [25]. Анализ межгенных взаимодействий выполнялся методом интенсивного поиска с помощью программы MDR v1.1 (Мультифакторное Снижение Размерности) [22].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Частоты генотипов исследованных полиморфных сайтов генов MMPs в основной и контрольной группах представлены в табл. 3.
Распределение частот генотипов в контрольной группе по каждому из локусов соответствовало ожидаемому согласно закону Харди-Вайнбер-
232 ЯРМОЛИНСКАЯ и др.
Таблица 2. Аллельные варианты генов и эндонуклеазы рестрикции
Ген, полиморфизм Размер ПЦР продукта, пн Эндонуклеаза Аллель и размер фрагментов рестрикции (пн)
ММР3 ге3025058 129 7Ш111 5G - 97 + 32 6G - 129
ММР7 ге11568818 150 EcoR1 А - 150 G - 120 + 30
ММР9 ге17576 359 BstFN1 G - 19 + 226 + 114 А - 245 + 114
ММР9 ге2250889 199 BstFN1 G - 21 + 178 С - 199
ММР12 ге2276109 281 Bst4C1 G - 154 + 62 + 30 + 35 А - 216 + 30 + 35
ММР13 ге2252070 312 Bst4C1 А - 125 + 188 G - 125 + 164 + 22
Таблица 3. Частота генотипов по полиморфным сайтам генов ММР8 в основной и контрольной группах
Группа
Генотип основная (n = 78) контрольная (n = 45) Достоверность, p
n % n %
MMP3 (rs3025058) - 5A/5A 18 23.1 4 8.9 =0.046
MMP3 (rs3025058) - 5A/6A 38 48.7 27 60.0 >0.05
MMP3 (rs3025058) - 6A/6A 22 28.2 14 31.1 >0.05
MMP7 (rs11568818) - A/A 34 43.6 14 31.1 >0.05
MMP7 (rs11568818) - A/G 32 41.0 19 42.2 >0.05
MMP7 (rs11568818) - G/G 12 15.4 12 26.7 >0.05
MMP9 (rs17576) - A/A 31 39.7 26 57.8 >0.05
MMP9 (rs17576) - A/G 38 48.7 11 24.4 =0.03
MMP9 (rs17576) - G/G 9 11.5 8 17.8 >0.05
MMP9 (rs2250889) - С/С 69 88.5 40 88.9 >0.05
MMP9 (rs2250889) - С/G 8 10.3 5 11.1 >0.05
MMP9 (rs2250889) - G/G 1 1.3 0 0.0 >0.05
MMP12 (rs2276109) - A/A 60 76.9 36 80.0 >0.05
MMP12 (rs2276109) - A/G 15 19.2 7 15.6 >0.05
MMP12 (rs2276109) - G/G 3 3.8 2 4.4 >0.05
MMP13 (rs2252070) - A/A 34 43.6 15 33.3 >0.05
MMP13 (rs2252070) - A/G 29 37.2 23 51.1 >0.05
MMP13 (rs2252070) - G/G 15 19.2 7 15.6 >0.05
га. Их сравнение с таковыми у больных НГЭ выявило существенное различие частот встречаемости гомозигот по редкому аллелю 5А генотипа гена ММР3 (23.1% у больных против 8.9% в контрольной группе, р = 0.046) ( табл. 3).
Известно, что редкий аллель 5А гена ММР3 характеризуется высокой промоторной активно-
стью [2, 12]. Повышенная частота гомозигот по этому аллелю ранее была отмечена для многих заболеваний, сопровождающихся деструкцией тканей (злокачественные опухоли, в особенности колоректальный рак, аневризмы крупных сосудов, острый инфаркт миокарда) [13, 14]. Так, в исследованиях ревматоидного артрита установлено, что некоторые аллельные варианты генов ММР1
Таблица 4. Анализ межгенных взаимодействий ММР при НГЭ методом интенсивного поиска с помощью программы МБЯ у1.1
Число Сбалансиро- Воспроиз-
локусов Наиболее значимые комбинации локусов в модели ванная p водимость,
в модели точность %
1 MMP9 (rs17576) 0.6213 0.3770 100
2 MMP7(rs11568818) х MMP9 (rs17576) 0.6665 0.9453 50
3 MMP3 (rs3025058) х MMP7(rs11568818) х MMP9 (rs17576) 0.7764 0.0107 100
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.