МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 4, с. 403-410
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.083.13
ATФ-ПУЛ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ АКТИВНОСТЬ У ПСИХРОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РИОТОВЛСТЕЯШМ РИОБРИОЯЕиМ
© 2014 г. Л. Э. Алескерова*, К. А. Аленина*, Е. Н. Ефременко**, М. М. Мажуль*, Н. Ф. Пискункова*, А. Д. Исмаилов*, 1
*Кафедра микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
**Кафедра химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 05.11.2013 г.
Исследована биолюминесцентная активность и пул АТФ в растущей культуре психрофильных бактерий Рко(оЬас(епыт ркозркогеыт, клетках фазы роста, стационарной фазы, а так же иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта (ПВС). Установлено, что у изучаемых фотобактерий на протяжении всего (более 100 ч) люминесцентного цикла глубинной культуры пул АТФ сохраняется практически на постоянном уровне клеток. Постоянство пула АТФ наблюдается в клетках стационарной фазы и иммобилизованных в ПВС при их инкубации в течение более чем 200 ч в среде культивирования и более 100 ч в 3% №С1. Проведена количественная оценка интегрального выхода фотонов и пула АТФ, на основании которой сделан вывод, что затухание свечения в растущей культуре или стационарных клетках не является следствием лимитирования энергетическими субстратами люциферазной реакции. Кинетические и количественные показатели по эмиссионной активности и пула АТФ противоречат возможности формирования альдегидного субстрата люциферазы в клетке путем восстановления соответствующей жирной кислоты в МАВРЫ и АТФ-зависимой редук-тазной реакции и его окисления в монооксигеназной реакции люциферазы. Полученные результаты свидетельствуют, что алифатический альдегид не утилизируется в эмиссионном процессе.
Ключевые слова: психрофильные фотобактерии, люминесцентный цикл, пул АТФ, иммобилизация, поливиниловый спирт.
DOI: 10.7868/S002636561404003X
Люминесцентная активность фотобактерий контролируется комплексно многими элементами, в первую очередь субстратами и кофакторами люминесцентной системы, а также аутоиндукто-рами, температурой, рН, что отражается в профиле биолюминесцентной активности растущей культуры и кинетике затухания люминесценции в клетках стационарной фазы [1—3].
Длительность люминесцентного цикла растущей культуры, включающего фазу индукции, стационарного свечения и затухания, у разных видов микроорганизмов различна. У бактерий Vibrio har-veyi весь цикл люминесцентных изменений полностью проходит в фазе роста в течение 12—14 ч [4, 5], у Photobacterium phosphoreum продолжительность люминесцентного цикла от 1 до 7 сут [6, 7].
Природа процессов, определяющих переход к стадии затухания мало изучена. Затухание свечения в развивающейся культуре может быть связано
1 Автор для корреспонденции (e-mail: anvaris@list.ru).
с изменениями в среде культивирования (сдвиг рН, накопление ингибиторных продуктов), перестройкой клеточного метаболизма (биосинтез альтернативных акцепторов электронов, разобщение электронтранспортной цепи, рост темно-вых утечек на пути переноса электронов на люци-феразу), субстратным лимитированием, инактивацией люциферазы.
Особое значение для эмиссионного процесса имеет пул АТФ, который является интегральным индикатором темновых и световых реакций. Содержание АТФ в клетках фотобактерий по данным разных авторов составляет 0.2—2.0 х 10-18 моль на клетку [4, 8]. Несмотря на то, что АТФ не включается непосредственно в световую реакцию, окисление восстановленного флавина и альдегидной молекулы люциферазой бактерий с эмиссионной активностью 104—105 квант х с-1 кл-1, может представлять потенциальную конкуренцию за электроны, необходимые для синтеза АТФ.
Сведения о динамике пула АТФ в процессе роста культуры фотобактерий имеют противоречивый характер. Улитзур и Гастингс [4] обнаружили 10-20-кратное снижение пула АТФ в период индукции люминесценции при глубинном росте Vibrio (Beneckea) harveyi. Противоположные результаты по динамике пула АТФ в растущей культуре получены Карлом и Нельсеном [8], которые на 4 разных видах фотобактерий провели анализ АТФ и GTP-пула, поглощения кислорода, нагрузки аденилатной системы и установили, что все энергетические параметры остаются постоянными в процессе всех фаз роста, в то время как интенсивность люминесценции изменяется на несколько порядков. Обсуждая противоречия их данных результатам работы [4], авторы предполагают, что падение пула АТФ у V. harveyi могло быть связано с активацией АТФ-азы. Таким образом, до настоящего времени нет ясности в соотношении энергетических процессов, контролирующих как процесс индукции, так и затухание свечения растущей культуры бактерий. В определенной степени это могло быть связано с коротким периодом люминесцентного цикла у использованных в указанных работах видов фотобактерий.
Психрофильные штаммы бактерий P. phos-phoreum отличаются наиболее длительным (более 100 ч) свечением при развитии в глубинной культуре [7]. Иммобилизация клеток бактерий позволяет дополнительно пролонгировать свечение [9, 10], что создает предпосылки более корректной оценки люминесцентных и энергетических характеристик иммобилизованных клеток по сравнению со свободными клетками. Для иммобилизации клеток самых разных групп микроорганизмов широко применяется криогель поливинилового спирта (ПВС) [11]. Данные по иммобилизации клеток природных и генно-инженерных штаммов с клонированными генами люциферазы бактерий в данном носителе представлены в работах [9, 11, 12]. Детальное исследование факторов, стабилизирующих свечение, эмиссионные и кинетические параметры иммобилизованных в ПВС клеток P. phosphoreum, V. fis-cheri и V. harveyi проведено нами ранее [9, 13]. Использование технологии криогенной иммобилизации фотобактерий в криогеле ПВС позволило существенно увеличить длительность и стабильность эмиссии света. При инкубации препаратов при 4°C стабильный уровень эмиссии сохранялся в течение 200 ч, а детектируемый уровень эмиссии иммобилизованных клеток — до 1 мес.
Целью настоящей работы являлось исследование динамики изменения пула АТР и люминесцентной активности в клетках развивающейся культуры психрофильных бактерий Photobacteri-um phosphoreum: клетках фазы роста, стационарной фазы и иммобилизованных в криогеле ПВС.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальный штамм и условия выращивания.
В работе использованы светящиеся бактерии РНо1оЬас1егшт ркозрИогвит, штамм 331 (ККМ МГУ), выделенные из кишечника рыбы Муохо-серка1ш scorpius в Белом море. Бактерии выращивали в глубинной культуре в комплексной среде, содержащей (г/л): ШС1 - 30.0; Ш2ИР04 - 5.3; КН2Р04- 2И20 - 2.1; (МИ4)ИР04 - 0.5; MgSO4 ■
■ 7И20 - 0.1; дрожжевой экстракт - 1.0; пептон -5.0; глицерин- 3.0; рИ 7.5 [7], при 20°С в течение 22 ч статически (фаза замедленного роста) до достижения клеточной плотности биомассы 5-8 ■
■ 109 кл/мл.
500 мл культуры осаждали центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин), отмывали однократно ^-фосфатным буфером с 2% №С1, рИ 7.6. Повторно центрифугировали в тех же условиях. Полученный осадок клеток использовали в процедурах иммобилизации.
Процедура иммобилизации. Иммобилизацию клеток фотобактерий проводили в соответствии с методикой [9]. Осажденные отмытые клетки ре-суспендировали в 13% растворе ПВС (Мм - 48000) до получения однородной суспензии. Раствор ПВС готовили на основе среды культивирования. Клеточную суспензию (по 200 мкл) разливали в ячейки 96-луночных планшетов, замораживали при -20°С, выдерживали в замороженном состоянии в течении 17 ч для образования криогеля и хранили при -8°С. Состав полученного препарата (мас. %): биомасса бактерий - 0.62; поливиниловый спирт - 6.8. Размораживание планшетов с гранулами проводили в течение 17 ч, размороженные гранулы хранили при 4°С в 0.1 М Ма-фосфатный буфере с 2% ШС1, рН 7.6.
Определение эмиссионной активности люминесцентных бактерий. Биолюминесценцию клеток растущей культуры, суспензированных и иммобилизованных клеток определяли на люминометре 1250 LKB ('^аПас", Швеция), при комнатной температуре и выражали в относительных единицах (о.е.). Оценку абсолютных значений выхода фотонов квант/с) проводили в соответствие со стандартом Гастингса и Вебера [15]: 1 о.е. = 2 х 109 квант/с. Биолюминесцентную активность клеток культуры или суспензии, определяли в пробах, содержащих клетки в разведении в 106-104 кл/мл в 0.1 М Ма-фосфатного буфера с 2% №С1, рИ 7.6. Активность иммобилизованных клеток определяли по максимуму свечения одной гранулы в 1 мл того же буфера после 1-2 мин выравнивания температуры гранул и раствора и нормировали на количество клеток в препарате.
Определение биомассы. Концентрацию клеток в растущей культуре или суспензии определяли спектрофотометрически (А630пт) на спектрофо-
Время, ч
Рис. 1. Динамика роста (1), удельной биолюминесцентной активности (2), и АТР пула (3) при глубинном культивировании бактерий Р. phosphoreum в комплексной среде при 20°С.
тометре (Beckman 35 США, l = 1 см, X = 630 нм) количество клеток в гранулах — по содержанию АТР биолюминесцентным методом с использованием люциферазы светляков [17]. Во всех случаях использовали биолюминесцентный реагент фирмы "Люмтек", Россия.
Определение АТФ. Разрушение клеток и экстракцию АТФ проводили путем обработки клеточной суспензии или препаратов иммобилизованных в ПВС клеток ДМСО: 100 мкл суспензии бактерий или 1 гранулу иммобилизованных в криогеле клеток смешивали с 1 мл ДМСО, и через 10 мин проводили биолюминесцентный анализ содержания АТФ в пробах. Система измерения: 1 мл 0.1 М Трис-HCl буфера (pH 7.6) + 20 мкл пробы + 50 мкл люминесцентного реагента с люцифе-разой светляков. Мерой количественной оценки АТФ служила максимальная интенсивность эмиссии при использовании калибровочного графика: "интенсивность эмиссии (I — 1фон)/[АТФ]".
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Excel. Каждое значение в графическом построении является средним из трех измерений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлены динамика ро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.