БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.1144-1148
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3
АТОПИЧЕСКИ ТРАНСПЛАНТИРОВАННЫЕ ТКАНИ ТИМУСА СПОСОБНЫ ДИСТАНТНО ИЗМЕНЯТЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ
СТАТУС ОРГАНИЗМА
© 2008 г. А.В. Куликов, Л.В. Архипова, Е.Г. Новоселова*, Н.В. Шишова*,
Д.А. Куликов**, Г.Н. Смирнова
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области;
E-mail: Kulikov@ited.ru *Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области; **Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6
Установлено, что атопнчеекая трансплантация тканн тимуса от молодых животных в различных ее вариантах способна достоверно снижать темп необратимой возрастной атрофии тимуса, что приводит к торможению возрастной деградации Т-клеточного звена иммунологической системы организма.
Ключевые слова: криоконсервация, трансплантация, тимус, радиационное облучение, компенсация, иммунологически привилегированные области организма.
Одной из наиболее сложных и окончательно не решенных проблем современной трансплантологии является иммунологическая несовместимость ткани донора и реципиента. Имеется несколько путей частичного решения подобного рода задач. Это применение иммунодепрес-сантов, создание банка данных доноров и реципиентов, сочетанные процедуры и пр. Все эти подходы имеют свои плюсы и минусы. В своих исследованиях мы применяли другие подходы, позволяющие «обойти» иммунологическую защиту организма [1-3]. Это использование относительно иммунопривилегированных участков организма для пересадки тканей [4-6] и длительная криоконсервация собственных ау-тологических клеток. В последнем случае пересаживаются клетки собственного тимуса, на которые нет иммунного ответа, в то же время, эти клетки хороши тем, что их развитие остановлено на ранней стадии, когда их пролифе-ративный потенциал очень велик. Роль тимуса как одного из центральных органов иммунитета не подвергается сомнению [7-9]. Удаление тимуса приводит к дегрануляции соматотропных клеток гипофиза, снижению функции коры надпочечников и половых желез [10]. У мышей, тимэктомированных в неонатальном периоде, наблюдаются нарушения нейроэндокринных функций [11]. Именно поэтому ткань молодого тимуса использовалась нами для компенсации
Сокращение: ФНО-а - фактор некроза опухолей.
метаболических нарушений, характерных для стареющего организма.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использовали крыс линии Животных выращивали в условиях вивария на стандартной диете. Эксперименты по облучению проводили на гамма-установке в специальных контейнерах, куда помещали не более пяти животных одновременно. Облучение осуществляли у-лучами 60Со с мощностью дозы 1,5 - 1,6 Гр/мин в течение 2,5 - 5 мин при комнатной температуре.
Трансплантируемую ткань тимуса выделяли из крыс - самцов массой 120 г. Ткань тимуса измельчали в чашке Петри со средой Игла до получения частиц размером 1 мм3. Трансплантацию проводили под эфирным наркозом. Материал отбирали из чашки Петри и трансплантировали его в переднюю камеру глаза животного модернизированной микропипеткой с изменяющимся объемом: в разрез длиной 1,5 -2 мм медленно выдавливали трансплантируемые кусочки ткани объемом 3 - 5 мм3 и помещали их на радужную оболочку глаза, как можно дальше от разреза. И ммуно депрессанты ни до, ни после операции не использовали.
Для определения количества тимоцитов после декапитации животных вскрывали грудную полость, извлекали тимус и помещали его в солевой раствор Хенкса без фенолового крас-
ного c глюкозой (5 ммоль/л) и антибиотиком (гентамицин, 10 мкг/мл), содержавший 20 ммоль/л HEPES (Serva, США), рН 7,2, температура 37°С. Тимусы протирали через капроновый фильтр, однократно отмывали после центрифугирования при 700 g в течение 5 мин и ресуспендировали в растворе Хенкса или RPMI-1640 (Serva, США) до требуемой концентрации в интервале 105 - 108 клеток в 1 мл. Концентрацию клеток определяли, подсчитывая их в камере Горяева. Клетки инкубировали либо в пластиковых чашках Петри, либо в ячейках 96-луночного плоскодонного планшета.
Для криоконсервации тканей тимуса применяли способ, уже отработанный для других объектов, представляющих собой гетерогенную клеточную систему, как, например, мозг моллюска, ткань семенника амфибий и т.п. [12,13]. Замораживали кусочки ткани, не превышающие по размерам 1 х 1 х 0,5 мм. В качестве кри-опротектора использовали диметилсульфоксид в конечной концентрации 2 М. Криопротектор добавляли при температуре 0°С, постепенно, в течение 30 мин. Замораживание до -70°С осуществляли в парах азота со скоростью 10°/мин, затем образец погружали в жидкий азот (-196°С). Размораживание проводили на водяной бане при температуре 40°С до исчезновения кристаллов льда. Затем криопротектор отмывали в течение 30 мин при температуре 0°С.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе мы провели долгосрочные исследования темпа необратимой возрастной деградации тимуса у крыс в возрасте 2,5; 4; 5; 7; 8; 19 и 20 месяцев. Не останавливаясь на деталях, отметим лишь, что количество тимо-цитов у 20-месячных животных по сравнению с молодыми 2,5-месячными крысами было уменьшено в 90,6 раза. Цель данного этапа работы состояла в изучении возможности снижения темпа необратимой возрастной атрофии тимуса с помощью трансплантации ткани ви-лочковой железы от молодых крыс их стареющим сородичам.
Из данных, приведенных в табл. 1, видно, что трансплантация тимуса от молодых животных в переднюю камеру глаза более старых крыс приводит к убедительно достоверному торможению необратимой возрастной атрофии тимуса.
После проведения вышеописанных экспериментов мы попытались выяснить, может ли трансплантат иммунокомпетентной ткани в условиях, обеспечивающих ему достаточно длительное выживание, положительно влиять на
Таблица 1. Количество тимоцитов в вилочковой железе животных разного возраста через три месяца после трансплантации (х107)
Возраст животных, мес Контроль Опыт
5 2,2 ± 0,45 n = 4 6,5 ± 0,63 n = 5 , p < 0,001
1,2 ± 0,13 2,7 ± 0,25
7 n = 5 n = 5 p < 0,001
0,33 ± 0,07 0,9 ± 0,11
8 n = 6 n = 6 p < 0,001
Примечание. п - число животных.
последствия радиационного облучения разной интенсивности. Известно, что радиационный стресс, как и многие другие виды стрессов, приводит к акцедентальной атрофии тимуса. Мы выбрали радиационный стресс потому, что он является наиболее воспроизводимым и точным по дозировке. В первой серии для проверки влияния трансплантата тимуса на репаратив-ную регенерацию костного мозга и его функциональную активность мы оценивали выживаемость крыс после облучения дозой 8 Гр, вызывающей гибель крыс в течение 30 дней после облучения. Гибель при этой дозе обусловлена поражением стволовых кроветворных клеток и, как следствие, дефицитом кроветворения.
В табл. 2 представлены данные, показывающие, что в группе 3-месячных крыс, которым после облучения летальной дозой 8 Гр трансплантировали в переднюю камеру глаза тимус, существенно увеличилась выживаемость. В течение одного месяца она составила 54%, в то время как в группе, животным которой после облучения трансплантацию не проводили, через 1 мес выжила лишь одна крыса (2,9%), но и она умерла на пятой неделе. Через три месяца в опытной группе выжило шесть животных, через шесть месяцев - три, и одна крыса прожила 13 месяцев. Результаты получены в весенне-летний период.
Когда стало ясно, что даже при столь высокой дозе облучения возможно положительное влияние трансплантации иммунокомпетентных клеток, мы провели несколько серий трансплантационных экспериментов после облучения животных сублетальной дозой ионизирующей радиации. Известно, что при облучении дозой 4 Гр происходит массовая гибель клеток в тимусе
1146 КУЛИКОВ и др.
Таблица 2. Влияние трансплантации тимуса на выживаемость животных после облучения дозой 8 Гр
Выживаемость, %
Условия Число крыс через 1 мес через 3 мес через 6 мес через 13 мес
Облучение 8 Гр 35 1* (2,9%) 0 0 0
Облучение 8 Гр + трансплантация тимуса 24 13* (54,2%) 6* (25%) 3* (12,5%) 1* (4,13%)
Примечание. * - Число выживших крыс.
и костном мозге с последующим восстановлением клеточности через 20 - 40 дней [14]. В геронтологии такое воздействие еще называют ускоренным старением. Проведено исследование клеточности тимуса у животных разных возрастных групп после облучения дозой 4 Гр и последующей трансплантацией ткани тимуса, костного мозга или легкого (контроль на специфичность ткани).
Как видно из табл. 3, через 1 мес после облучения у животных без трансплантации им-мунокомпетентных тканей количество тимоци-тов достоверно ниже, чем у животных группы интактного контроля. Трансплантация ткани тимуса или костного мозга способствует полному восстановлению клеточности тимуса. Кроме того, крысам одной группы после облучения мы трансплантировали ткани легкого. Эти животные служили контролем на специфичность ткани. Через 1 мес после трансплантации, как и следовало ожидать, количество клеток в ви-лочковой железе животных этой группы не отличалось от такового в группе, в которой трансплантация ткани после облучения не проводилась.
Далее была проведена работа по замедлению темпа необратимой возрастной атрофии тимуса, но уже без использования иммуноло-гически привилегированных зон. У одномесяч-
ных крыс вырезали часть тимуса и подвергали длительной криоконсервации (4,5 и 6,5 мес), затем аутотрансплантаты пересаживали животным в жировую клетчатку и еще через 3,5 мес исследовали гематологические, физиологические и иммунологические показатели животных. Стимулом для проведения указанных исследований послужил тот факт, что одним из способов лечения миастении у детей является удаление тимуса. Как показали полученные результаты, собственный «молодой» тимус с высоким пролиферативным потенциалом может оказать весьма серьезную поддержку организму в зрелом и старческом возрасте.
Все исследованные гематологические показатели (количество эритроцитов, гемоглобин, гематокрит, средний объем эритроцитов, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, количество тромбоцитов) достоверно не отличались о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.