БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1282 - 1288
УДК 577.354
АЦИДОЗ И 5-(ЛТ-ЭТИЛ-ЛГ-ИЗОПРОПИЛ)АМИЛОРИД ^ЕД) СНИЖАЮТ ЦИНК/КАИНАТНУЮ ТОКСИЧНОСТЬ В КУЛЬТУРАХ ЗЕРНИСТЫХ НЕЙРОНОВ МОЗЖЕЧКА КРЫС
© 2015 Е.В. Стельмашук1*, С.В. Новикова1, Г.А. Амелькина1, Е.Г. Ивашкин1, Е.Е. Генрихс1, Л.Г. Хаспеков1, Н.К. Исаев12*
1 Научный центр неврологии РАМН, 125367Москва; электронная почта: estelmash@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва
Поступила в редакцию 10.12.14
/пС12 (0,005 мМ, 3 ч) или каинат (0,1 мМ, 3 ч) оказывали слабое токсическое действие на культивированные зернистые нейроны мозжечка (КЗН), однако одновременная обработка КЗН этими веществами вызывала интенсивную гибель нейронов, которая достоверно снижалась внешним ацидозом (рН 6,5) или 5-(Ы-этил-#-изопропил)амилоридом (Е1РА, блокатор №+/Н+ обмена, 0,03 мМ). Токсическое действие каи-нат+/пС12 вызывало повышение внутриклеточной концентрации ионов цинка и кальция ([/п2+] и [Са2+]1), что достоверно снижалось ацидозом и усиливалось в присутствии Е1РА. Регистрация [/п2+] в отдельных нейронах продемонстрировала, что Е1РА усиливает цинковую перегрузку цитозоля нейронов при инкубации в растворе, содержащем /п2+. Предполагается, что ацидоз уменьшает /пС12/каинатную токсичность посредством снижения входа /п2+ в нейрон, тогда как Е1РА предотвращает перегрузку цинком систем депонирования этого иона.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цинк, кальций, каинат, зернистые нейроны мозжечка, ацидоз, Е1РА.
Значительная часть глутаматергических синапсов в центральной нервной системе содержат ионы цинка, которые в большей своей части находятся в синаптических везикулах и колокали-зованы с глутаматом. Высвобождение 2п2+ при нейрональной активности важно для нормальной физиологической функции головного мозга [1]. Недавно было показано, что 2п2+ (подобно Са2+) может рассматриваться как вторичный передатчик сигнала клеточной гибели при гипоксии/ишемии и ряде других патофизиологических состояниях головного мозга [2—4]. В норме уровень ци-тозольного 2п2+ в нейронах очень низкий по сравнению с суммарным внутриклеточным содержанием этого иона [5], в то время как большая часть внутриклеточного цинка связана со специфическими белками и собрана внутри синапти-ческих везикул. В патофизиологических условиях [2п2+] в нейронах может внезапно возрастать [6—7]. Цинк, вышедший в синаптическую щель транспортируется большей частью через постси-наптическую мембрану, используя 2п2+- и Са2+-
* Адресат для корреспонденции.
проницаемые каналы, ассоциированные с АМРА-рецепторами и потенциал-зависимыми Са2+-каналами [6, 8]. Однако гипоксия/ишемия сопровождается вне- и внутриклеточным ацидозом, который может влиять на проницаемость ионных каналов и внутриклеточный гомеостаз цинка. Показано, что в добавление к кальциевому дисбалансу аккумуляция 2п2+ системами внутриклеточного депонирования блокируется ацидозом [9]. Внеклеточный ацидоз сопровождается прогрессивным увеличением [2п2+] в КЗН [10, 11]. Умеренный ацидоз увеличивает опосредованную АМРА/каинатными рецепторами мобилизацию внутриклеточного цинка в кортикальных нейронах [12]. Однако в настоящее время остается неизвестным, как ацидоз может влиять на гибель нейронов, которая опосредована входом цинка в нейроны при активации АМРА/каинатных рецепторов, что может происходить при гипоксии/ишемии головного мозга. Эта проблема была рассмотрена в нашем исследовании, используя КЗН, подвергнутые ацидозу, инициированному закислением инкубационной среды или ингибированием №+/Н+-обмена.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Первичные культуры мозжечка крыс. В работе использовали 7-9-дневные культуры зернистых нейронов мозжечка, полученные из мозга 8-су-точных крыс линии Wistar методом ферментно-механической диссоциации [10], которую проводили следующим образом: выделенные мозжечки переносили в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, лишенным ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37° в фосфатном буфере, который содержал 0,05%-ный трипсин и 0,02%-ную ЭДТА. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в среде культивирования. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых планшетах, покрытых полилизином, или на круглых стеклах, помещенных в пластиковые чашки диаметром 35 мм. Питательная среда содержала: 90% минимальной среды Игла на солях Эрла, 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, 2 мМ глутамина и 10 мМ буфера HEPES, pH 7,2-7,4. В каждую ячейку добавляли 0,1 мл суспензии клеток. Культуры развивались в СО2-инкубаторе при температуре 36,5° и относительной влажности 98%. На второй день среда заменялась свежей, содержащей 25 мМ KCl, в которой культивирование клеток продолжали до 7-8 дня in vitro.
Все экспериментальные протоколы были одобрены Этическим комитетом «НЦН» РАМН (протокол № 05/10).
Фармакологическая обработка. Эксперименты по выживаемости КЗН проводили в сбалансированном солевом растворе следующего состава (в мМ): NaCl 154, KCl 25, CaCl2 2,3, MgCl21, NaHCO3 3,6, Na2HPO4 0,35, HEPES 10, pH 7,3. Умеренный ацидоз создавали, понижая рН солевого раствора до 6,5. Непосредственно в инкубационный раствор вносили 10 мкл на мл ZnCl2 (0,5 мМ в деионизированной воде), 10 мкл на мл каината (10 мМ в деионизированной воде) и блокатор Na+/H+ обмена 5-(^-этил-^-изопро-пил)амилорид (30 мМ EIPA в DMSO) 1 мкл на мл. Культуры были разделены на 12 групп: без добавок, с добавлением Zn2+ (0,005 мМ, 3 ч), с добавлением каината (0,1 мМ, 3 ч), с добавлением одновременно Zn2+ и каината (каинат + ZnCl2), причем все вышеперечисленные группы инкубировали в трех вариантах: 1) рН 7,3; 2) рН 6,5; и 3) с добавлением EIPA (0,03 мМ), рН 7,3.
Оценка выживаемости нейронов. Выживаемость КЗН оценивали как было опубликовано ранее [13]. После эксперимента культуры фиксировали в смеси этанол-формальдегид-уксус-
ная кислота (7 : 2 : 1) и окрашивали трипановым синим. Процент выживших нейронов оценивали подсчетом морфологически интактных ядер КЗН в пяти полях зрения при увеличении объектива x4G. Выживаемость нейронов в необработанных контрольных культурах принимали за 1GG%, выживаемость в экспериментальных культурах выражали в процентах относительно контроля.
Определение [Zn2+]¡ [Ca2+]¡. Клетки загружали G,GG5 мM FluoZin-3 AM или G,GG5 мM Fluo-4 AM 3G мин при 36,5 ± G,5° с последующим трехкратным отмывом сбалансированным солевым раствором, pH 7,3. Для определения относительного уровня [Zn2+]j или [Ca2+]j использовали микропланшетный флуоресцентный сканер (CytoFluor II, «PerSeptive Biosystems», США). Измерение флуоресценции FluoZin-3 или Fluo-4 производили в 96-луночных культуральных планшетах при возбуждении синим светом с длиной волны 488 нм и регистрировали эмиссию 53G нм. Регистрацию ионов цинка и кальция в отдельных КЗН производили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа («Olympus», Япония) с имидж-системой в культурах, выращенных на тонких стеклах. Эти культуры помещали в перфузионную камеру (объем G,2 мл), наблюдение в которой осуществляли с помощью инвертированного микроскопа (объектив x6G, NA 1.42, масляная иммерсия). Изображение регистрировали с помощью 12-битной цифровой камеры и анализировали с использованием программы «Fiji Is Just ImageJ». Изображения регистрировали каждые 5 с при температуре 3G°. Вещества вносили и удаляли из камеры с помощью проточной системы. В качестве зоны регистрации использовали все тело отдельного нейрона. Кинетика изменения флуоресценции была исследована в 4G—5G нейронах с использованием программы «Microsoft Excell». Флуоресцентные изображения клеток при регистрации Zn2+ были выполнены при эмиссии 53G нм (ширина полосы пропускания 15 нм) и возбуждении 485 нм (продолжительность импульса освещения 1GG—2GG мс).
Реагенты. Питательные среды и их компоненты получены от «Biochrom KG» (Германия). FluoZin-3 AM и Fluo-4AM «Molecular Probes» (США), EIPA и другие реагенты «Sigma Chemicals» (Германия).
Статистический анализ. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с посттестом Newman—Keuls. Отличия между группами считали достоверными приp < G,G5. Результаты выражали как среднее ± SEM. Все данные получены на 9 культурах в трех независимых экспериментах.
БИОХИMИЯ том 8G вып. 8 2G15
1G*
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние EIPA, ацидоза, Zn и каината на выживание КЗН. Воздействие Е1РА (0,03 мМ, 3 ч), ацидоза и 2иС12 (0,005 мМ) (каждое в отдельности) оказывало слабое влияние на выживаемость нейронов (рис. 1). Подсчет нейронов с нормальной морфологией после 3 ч обработки культур каинатом (рН 7,3) показал, что выживало 78 ± 4% КЗН. Изменение выживаемости КЗН ацидозом (рН 6,5) и Е1РА при токсическом действии каината было недостоверно. Добавление в сбалансированный солевой раствор, содержащий 2и2+ (0,005 мМ рН 7,3), каината (0,1 мМ) вызывало интенсивную гибель нейронов в культуре (рис. 1, а, б, пикнотические ядра погибших нейронов показаны стрелками). После 3 ч инкубации в таких условиях выживало только 26 ± 2% КЗН. Ацидоз (рН 6,5) или добавление Е1РА (0,03 мМ) защищали КЗН от совместного токсического действия каината и 2иС12 (каинат + 2иС12, рис. 1).
Измерение в культурах. Изучение вли-
яния добавления цинка в раствор инкубации на ^п2+] в КЗН производили с помощью микропланшетного флуоресцентного сканера. Обнаружено, что добавление в сбалансированный солевой раствор (рН 7,3) одного 2пС12 или совместно с каинатом вызывало возрастание интенсивности флуоресценции F1uoZin-3 в культурах через 90 мин в среднем до 176 ± 10% и 210 ± 22% соответственно, в сравнении с базальным уровнем (рис. 2, а). Внешний ацидоз (рН 6,5) достоверно снижал, а Е1РА увеличивал ^п2+] при экспозиции культур с ZnC12 или каинат + ZnC12 (рис. 2, а).
Измерение [Ca2+]i в культурах. Анализ влияния добавления цинка в раствор инкубации на флуоресценцию F1uo-4 в нейрональных культурах производили с помощью микропланшетного флуоресцентного сканера. Обнаружено, что добавление в ин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.