МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 94-98
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.288.4.917.6
АУТОРЕГУЛЯЦИЯ ПРОРАСТАНИЯ КОНИДИЙ МИКРОМИЦЕТОВ РОДА TRICHODERMA
© 2004 г. Л. М. Полянская*, Т. Е. Толстихина*, Г. А. Кочкина**, Н. Е. Иванушкина**, С. М. Озерская**, О. Т. Ведина***, Д. Г. Звягинцев*
*Факультет почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
***Baicor, L.C., Logan, Utah, USA Поступила в редакцию 29.07.02 г.
Изучено прорастание конидий микромицетов рода Trichoderma. Доля прорастающих конидий во всех случаях существенно снижается при повышении показателя популяционной плотности. Наблюдаются различия в экологической стратегии между штаммами. Максимальное количество проросших конидий (30-70%) регистрируется при среднем расстоянии между конидиями 50 мкм.
Ключевые слова: микромицеты, конидии.
Промышленные штаммы рода ТпсНойвгта широко используются в сельскохозяйственной практике для контроля размножения популяций патогенных грибов в почве, а также на семенах различных растений, в ризосфере и филлосфере [1]. Рекомендуется также использовать культуры ТпсНойвтта для сохранения убранного урожая [2-5]. Перед потребителем микробных препаратов встает ряд практических трудностей. Экономическая эффективность использования живого микробного препарата определяется вероятностью активной колонизации субстрата популяци-ей-интродуцентом. Конидии грибов рода ТпсНо-йвтта чрезвычайно удобны для приготовления сухих препаратов, однако, необходимо знать, какими факторами обусловливается прорастание конидий после внесения их в природное местообитание. Активно изучается влияние различных параметров внешней среды на поведение микробных популяций, однако в экологии значительную роль
играет внутрипопуляционное взаимодействие. В литературе имеются указания на существование механизмов ауторегуляции процесса активизации покоящихся форм микроорганизмов [6, 7].
Целью настоящей работы являлась проверка наличия внутрипопуляционной регуляции прорастания конидий различных штаммов рода Trichoderma.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследованные культуры микромицетов были выделены из ризосферы роз сортов Grand Gala, Royal Velvet и Dallas. Четыре отобранных для работы штамма являются типичными представителями рода Trichoderma (таблица).
Для получения конидий микромицеты культивировали на агаризованной среде Чапека с сахарозой (2%) в течение 7 сут при температуре 26°С.
Тестирование штаммы
Автор Источник выделения
Номер Вид Растение Анатомическая часть растения
FW826 Trichoderma longibrachiatum Rifai 1969 Роза Grand Gala Ризосфера
FW829 T. longibrachiatum Rifai 1969 Роза Dallas Ризоплана
FW827 T. harzianum Rifai 1969 Роза Royal Velvet Отмерший корень
FW828 T. harzianum Rifai 1969 Роза Dallas Внутренняя часть корня
Рис. 1. Процесс прорастания конидий микромицетов рода Тпско4вгша (а - начало опыта; 15 часов; в, г, д - дальнейший рост; е - образование микроколоний). Увеличение Х1000.
- прорастание спустя
Затем с помощью смыва получали суспензию конидий, которую трижды отмывали центрифугированием и с помощью ультразвуковой обработки (УЗДН-1, 22 кГц, 0.44 А, 30 с) получали моноспоровую суспензию. Для определения жизнеспособности конидий грибов из суспензии конидий готовили препараты на обезжиренных стеклах по стандартной методике [8]. Суспензии конидий наносили микропипеткой на тщательно обезжиренные предметные стекла (0.02 мл на препарат) и равномерно распределяли петлей на площади 4 см2. Для одного образца готовили 12 препаратов. Расчет количества конидий в 1 мл суспензии проводили по формуле:
N = an.lv Б2,
где N - число конидий в 1 мл суспензии; - площадь препарата (мкм2); а - количество конидий в одном поле зрения (усреднение производится по всем препаратам); п - показатель разведения суспензии (мл); V - объем капли, наносимой на стекло (мл); £2 - площадь поля зрения микроскопа (мкм2).
Плотность популяции определяли на препаратах, зафиксированных и окрашенных сразу после приготовления мазков. Для установления репродуктивной способности конидий приготовленные препараты до высыхания мазков помещали во влажную камеру и инкубировали при температуре воздуха 26°С и влажности 100% в течение 6, 15, 18, 24 и 39 ч. После инкубирования препараты высушивали на воздухе, фиксировали и окрашивали калькофлуором белым. Учет конидий про-
%
100 80 60 40 20 0
1 кондия/поле зрения
□ 5 кондий/поле зрения
□ 10 кондий/поле зрения
15 18 24 39
10 42 76 78
3.7 13.6 15 18
1.4 8.75 11 14.5
%
100 80 60 40 20 0
1 кондия/поле зрения
□ 5 кондий/поле зрения
£10 кондий/поле зрения
Ч\
к
15 18 24 39
13 33 80.9 86.5
5.4 13 27.9 29
4 16 19.4 22.4
т
%
100 80 60 40 20
у = 67.3961п(х) - 158.1 Я = 0.7595
♦ 1 кондия/поле
зрения ■ 5 кондий/поле
зрения А 10 кондий/поле зрения
у = 12.4991п(х) - 26.297 Я = 0.7068
1у = 12.0771п(х) - 28.647 Я = 0.8254
50 Ч
%
100 80 60 40 20
у = 78.551п(х) - 190.94
Я = 0.8240 ♦
10
♦ 1 кондия/поле
зрения ■ 5 кондий/поле
зрения А 10 кондий/поле зрения
у = 24.8161п(х) - 58.352 Я = 0.8018
Ау = 16.5061п(х) - 35.885 Я = 0.7266
40
50 Ч
Рис. 2. Содержание проросших во влажной камере конидий Т. longibrahiatum FW826 в зависимости от их плотности.
Рис. 3. Содержание проросших во влажной камере конидий Т. ка^апит FW827 в зависимости от их плотности.
%
100 80 60 40 20 0
1 кондия/поле зрения
□ 5 кондий/поле зрения
□.10 кондий/поле зрения
15 18 24 39
8.8 10.7 27 33
5.6 9 16 18
4.8 6 10 12
%
100 80 60 40 20 0
1 кондия/поле зрения
□ 5 кондий/поле зрения
□ 10 кондий/поле зрения
15 18 24 39
10.6 13.6 16.7 42.5
8.6 14.1 20 26
6.7 14.1 19.7 22.7
%
100 80 60 40 20
♦ 1 кондия/поле зрения ■ 5 кондий/поле зрения А 10 кондий/поле зрения
у = 1.0281х - 4.7987 Я = 0.8409
^ у = 0.4842х + 0.5289 Я = 0.7871 у = 0.2947х + 1.1263 Я = 0.8718
50 Ч
%
100 80 60 40 20
у = 1.3465х - 11.466 Я = 0.9635
♦ 1 кондия/поле зрения ■ 5 кондий/поле зрения А 10 кондий/поле зрения
у = 0.6667х + 1.175 Я = 0.9002
0.5719х + 2.0737
я = 0.7532 50 ч
Рис. 4. Прорастание конидий Т. кашапит FW828 в зависимости от их плотности.
Рис. 5. Прорастание конидий Т. longibrahiatum FW829 в зависимости от их плотности.
Ч
Ч
Ч
Ч
изводили на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ И-3. Площадь поля зрения составляла 9800 мкм2. Число конидий в поле зрения составляло 1, 5, 10 и 20, что соответствовало популяци-онной плотности 2 х 106, 1 х 107, 2 х 107 и 4 х 107. В качестве индекса обилия использовали среднее
расстояние между конидиями: r = J\IAm , где r -расстояние, m - популяционная плотность в расчете на единицу площади. На рис. 1 представлен процесс прорастания конидий микромицетов рода Trichoderma.
Для численность конидий доля среднего квадра-тического отклонения (8„ -1) не превышало 10%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 2 представлены данные по прорастанию конидий выделенного нами из ризосферы роз сорта Grand Gala штамма микромицета рода Trichoderma (T. longibrachiatum FW826). Можно видеть, что процесс прорастания конидий во влажной камере зависит от их обилия и может быть описан с помощью уравнений логарифмической регрессии (R - коэффициенты корреляции). Прорастание конидий регистрируется к 15-му ч инкубирования. Уже на этом этапе наблюдаются существенные различия между препаратами. При плотности конидий, составляющей 1 клетку в поле зрения, к 15-му ч прорастает около 10% конидий, при плотности в 5 клеток наблюдается около 4% проросших конидий, а при плотности в 10 клеток - только 1.5%. В дальнейшем наблюдается увеличение числа проросших конидий на всех препаратах в 4-6 раз, но в интервале 18-39 ч инкубирования процесс замедляется и после 39 ч затухает. При плотности конидий 20 клеток в поле зрения не наблюдалось их прорастания в течение всего срока инкубирования.
При исследовании прорастания конидий T. har-zianum FW827, выделенного из ризосферы роз сорта Velvet, наблюдались сходные закономерности (рис. 3). Прорастание конидий наблюдалось к 15-му ч инкубирования, однако на этом этапе доля проросших конидий не так резко убывала при увеличении их плотности, как в первом эксперименте. Для второго штамма также характерны снижение доли проросших конидий в интервале 18-39 ч инкубирования и затухание этого процесса в дальнейшем. В этом эксперименте также не наблюдалось прорастания конидий при плотности 20 клеток в поле зрения.
Конидии T. harzianum FW828 и T. longibrachiatum FW829, выделенных из ризосферы роз сорта Dallas, также начинали прорастать к 15-му ч инкубирования (рис. 4, 5). Процесс прорастания конидий в этих случаях описывается уравнениями линейной регрессии (с достаточно высокими коэффициентами корреляции R = 0.78-0.96). Здесь
% 100
80 h 60 40 20 h
у = 2.0465* - 14.103 R = 0.9816
♦ FW826 ■ FW827 ▲ FW828 X FW829
у = 0.8568* + 2.6516 R = 0.7581
у = 0.7161* - 1.2581 R = 0.8797
60 мкм
Рис. 6. Зависимость содержания проросших конидий штаммов рода Тпско4втта от среднего расстояния между конидиями (мкм).
также наблюдается выраженная зависимость доли проросших конидий от плотности их расположения на препарате в диапазоне от 1 до 5 клеток в поле зрения (однако при более низких конечных значениях доли проросших конидий к 39-му ч инкубирования на препарате с плотностью расположения в 1 клетку в поле зрения). При этом в случае со штаммом T. longibrachiatum FW829 доля проросших конидий не убывает с увеличением плотности расположения в диапазоне от 5 до 10 клеток в поле зрения, хотя при плотности 20 клеток в поле зрения и более прорастание конидий также не регистрируется.
На рис. 6 представлены данные о зависимости процесса прорастания конидий изученных штаммов рода Trichoderma от среднего расстояния между конидиями на препаратах. Во всех случаях наиболее благоприятен вариант с расстоянием 50 мкм и в трех случаях из 4 наименее благоприятен вариант с расстоянием 15 мкм. Наблюдаются различия между поведением популяций микромицетов, выделенных из ризосферы роз сортов Grand Gala и Royal Velvet и популяций и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.