научная статья по теме АВТОИНДУЦИРУЕМАЯ СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ, ОСНОВАННАЯ НА SIGB-ЗАВИСИМОМ ПРОМОТОРЕ OHRB, В BACILLUS SUBTILIS Биология

Текст научной статьи на тему «АВТОИНДУЦИРУЕМАЯ СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ, ОСНОВАННАЯ НА SIGB-ЗАВИСИМОМ ПРОМОТОРЕ OHRB, В BACILLUS SUBTILIS»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 6, с. 970-976

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.21

АВТОИНДУЦИРУЕМАЯ СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ, ОСНОВАННАЯ НА SigB-ЗАВИСИМОМ ПРОМОТОРЕ ohrB, В Bacillus subtilis#

© 2014 г. R. Panahi1, E. Vasheghani-Farahani1*, S. A. Shojaosadati1, B. Bambai2

1Faculty of Chemical Engineering, Tarbiat Modares University, P.O. Box 14115-114, Tehran, Iran 2National Institute for Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran Поступила в редакцию 06.04.2014 г.

Принята в печать 23.05.2014 г.

Высокопродуктивная наработка гетерологичных белков — важная задача, стоящая перед промышленной биотехнологией. И ее решение может быть достигнуто использованием автоиндуцируемых (автоиндуци-бельных) систем экспрессии. Сообщалось о разработке экспрессионной плазмиды на основе Bacillus subtilis с SigB-зависимым промотором ohrB. Экспрессионную систему проводили через процедуру культивирования клеток при высокой плотности (high cell density cultivation) для получения ксиланазы как стабильного модельного белка. Рекомбинантный штамм культивировали в искусственной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода. С целью предотвратить ингибирование субстрата использовали стратегию экспоненциальной подачи субстрата в культуру с подпиткой (exponential fed-batch feeding strategy). Резкое увеличение ксиланазной активности (приблизительно в 6 раз) в конце ферментации происходило в результате активации фактора сигма В (SigB), что подтверждает способность экспрессионной системы к автоиндукции. В случае контрольного штамма специфической индукции ксиланазной активности не происходило. Увеличение ксиланазной активности для рекомбинантного штамма было в 5 раз выше, чем для контрольного штамма. Кроме того, сконструированная система обладает резистентностью к катаболитной репрессии. Эта SigB-зависимая экспрессионная система может рассматриваться как инструмент биотехнологии и альтернатива снижения стоимости общепринятых индукторов, например изопропил-р-галактопиранозида.

Ключевые слова: вектор автоиндуцируемой экспрессии, Bacillus subtilis, ферментация, промотор ohrB, фактор сигма-B (SigB).

AUTO-INDUCIBLE EXPRESSION SYSTEM BASED ON THE SigB-DEPENDENT ohrB PROMOTER IN Bacillus subtilis, by R. Panahi1, E. Vasheghani-Farahani1*, S. A. Shojaosadati1, B. Bambai2 (1Faculty of Chemical Engineering, Tarbiat Modares University, P.O. Box 14115-114, Tehran, Iran, *e-mail: evf@modares.ac.ir; 2National Institute for Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran). The reliable production of heterologous proteins is important in the field of industrial biotechnology. This can be achieved by applying auto-inducible gene expression systems. The development of a Bacillus subtilis expression plasmid harboring SigB-dependent ohrB promoter was reported. The expression system was subjected to high cell density cultivation to produce xylanase as a stable model protein. The recombinant strain was cultured in a synthetic medium containing glucose as the carbon source. The exponential fed-batch feeding strategy was applied to prevent substrate inhibition. A sharp increase of xylanase activity (about 6-fold) at the end of the fermentation was observed as a result of sigma factor B (SigB) protein activation, supporting auto-inducibility of the expression system. For the control strain a specific induction of the xylanase activity was not observed. The recombinant strain was capable to offer a 5-fold increase in xylanase activity in comparison with the control strain. In addition, the constructed system displayed catabolite repression resistance ability. This SigB-dependent expression system can be considered as a biotechnology tool and an alternative to eliminate the cost of conventional inducers, e.g. isopropyl-p-galactopyranoside.

Keywords: auto-inducible expression vector, Bacillus subtilis, fermentation, ohrB promoter, sigma factor B. DOI: 10.7868/S0026898414060135

ВВЕДЕНИЕ

Bacillus subtilis привлекает внимание как хозяйский организм для продуцирования таких биомолекул как ферменты и белки терапевтической на-

# Статья представлена на английском языке.

* Эл. почта: evf@modares.ac.ir

правленности [1—3]. Эта грамположительная бактерия известна как организм GRAS (generally recognized as safe) благодаря отсутствию патоген-ности и эндотоксинов. К другим преимуществам

B. suЫШs относятся следующие: белки секретиру-ются непосредственно в среду, отсутствие значимых отклонений в частоте использования кодо-нов, генетика хорошо изучена, а процессы ферментации просты [4].

Для индустриальной биотехнологии важно наладить высокопроизводительную и недорогую технологию производства гетерологичных белков. Этого можно достигнуть разработкой системы экспрессии, технически совместимой с бактериальной. Индуцибельные системы наиболее популярны благодаря присущей им четкой системе регуляции. К распространенным недостаткам этих систем относятся высокая стоимость и/или токсичность индукторов, а также несовместимость с производством в промышленных масштабах [5]. Автоиндуцируемые системы экспрессии представляют собой адекватную альтернативу снижению стоимости общепринятых индукторов, таких как изопропил-Р-галактопиранозид (1РТО) и ксилоза [6—8]. Автоиндукция в B. suЫШs может быть достигнута при использовании промоторов, направляемых фактором сигма-В (81§В) [7]. 81§В-за-висимые промоторы активируются после воздействия разнообразных факторов стресса, таких как тепловой шок, солевой, кислотный или этаноло-вый стресс, и, кроме того, при дефиците кислорода, фосфата или глюкозы [9, 10]. Так, сконструирована 81§В-зависимая система экспрессии B. suЫШs, содержащая промотор gsiB, которая исследована при воздействии кислоты, этанола и теплового шока. В этой системе наблюдалось 3-13-кратное увеличение Р-галактозидазной активности, хотя о способности системы к автоиндукции не сообщалось [11]. Впоследствии рассматривали эписо-мальную, основанную на промоторе gsiB, систему экспрессии для доставки антигенов. Антиген сливали с промотором gsiB этого вектора, и рекомби-нантные клетки B. suЫШs вводили орально мышам, вызывая иммунный ответ у животных [12]. Другим примером может служить продуцирование стафилокиназы в B. suЫШs с использованием промотора р43. Этот промотор транскрибируется РНК-полимеразами, содержащими фактор сиг-ма-А (81§Л) и 81§В, но главным образом холофер-ментом 81§В-РНК-полимеразы. Экспрессия целевого гена при 10%-ной концентрации растворенного кислорода фО) в 3 раза выше, чем при 50% DO [13, 14].

Ген ohrB в клетках B. suЫШs, который кодирует белок резистентности к органическим перокси-дам, представляет собой часть 81§В-зависимого регулона общего стресса. При анализе уровня мРНК ohrA обнаружено, что экспрессия этого гена резко и быстро индуцируется при дефиците глюкозы. Однако о разработке систем экспрессии, основанных на этих результатах, не сообщалось [9, 10]. Недавно показано, что система экспрессии B. suЫШs, основанная на 81§В-зависимом промоторе ohrB, индуцируется в ответ на специ-

фические стрессы окружающей среды и глюкоз-ное голодание [15].

В представленном исследовании кратко описана разработанная нами система экспрессии. Для оценки автоиндуцибельности системы ре-комбинантный штамм проводили через культивирование при высокой плотности [8]. С целью предотвратить клеточное голодание мы использовали стратегию периодической подачи субстрата в культуре с подпиткой — наряду с точным контролем параметров процесса.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Конструирование экспрессионной плазмиды.

Для экспрессии ксиланазы создана новая кассета генов — от промотора до терминатора. Так как точная длина промотора ohrB неизвестна, нами была выбрана вся область из 142 п.н. между ohrB и вышележащим геном ohrR, — чтобы весь промотор наверняка попал в состав конструкции (показано на рис. 1а). Последовательность гена ксила-назы B. subtilis AQ1, белка с надлежащей стабильностью [16], использована как модель экспрессии под промотором ohrB — для оценки его силы и ин-дуцибельности. Хорошо известная последовательность N-концевого секреторного сигнала гена amyQ (кодирует а-амилазу Bacillus amylolique-faciens), обеспечивающая высокий уровень секретируемости [17], заменена на природную последовательность гена ксиланазы, а последовательность, кодирующая гистидиновый тэг (His6), включена в З'-конец ксиланазного гена с целью упростить детекцию рекомбинантного белка. Этот ген клонировали после последовательности Шай-на-Дальгарно в области промотора ohrB.

Стоп-кодон и терминатор транскрипции гена xylA встраивали после гена ксиланазы. Для этого использованы уникальные сайты рестрикции: BamHI на 5'-конце гена ксиланазы и AvrII на З'-кон-це стоп-кодона. Концы кассеты фланкировали сайтами рестрикции для NheI и AatII. Цистрон (сигнальная последовательность, а также кодирующие ксиланазу и Н!з6—тэг) оптимизирован по кодонам с целью улучшения экспрессии в B. subtilis (рис. 1б). Сконструированную 879-членную кассету синтезировали с помощью GeneArt GmbH и клонировали в плазмиду pHTampxyl ("Cobra Biologies", Великобритания) по рестрикционным сайтам NheI и AatII, генерируя новый шаттл-вектор Escherichia coli—B. subtilis (pBSxylanase), как показано на рис. 2. Идентичность плазмиды подтверждена диагностическим расщеплением рестрик-тазами HindIII и BamHI. Последовательность синтезированной кассеты размещена в базе GenBank под номером KJ169727.

Конструирование штамма. В качестве экспресс-сирующего штамма использован B. subtilis BRB06 ("Cobra Biologies"); это триптофановый ауксо-

ohrR

- ohrB

ohrB

ohrR

Отобранный участок

gctagcTTTGTTCACCAACTCTTTTTTGTCATTCGATTCTATTGTATCTGAAAAACCTCACTTTTCCTATTCTCGGC

aaacatagcat|gtttââ|aaagat cagaaa|gggaaa|tataacaact|a|gat acaaataaggaggttgg gaaat a tga t С

cagaaaagaaaacgcacagtcagctttagactggttctgatgtgcacactgctgtttgtttcactgccgattacaaa

aacatcagcagttggatccgcaggcacagattattggcaaaattggacagatggcggaggcacagttaatgcagtca

atggctcaggcggaaattattcagttaattggtcaaacacaggcaactttgttgttggcaaaggctggacaacaggc

agcccgtttagaacaattaactataatgcaggcgtttgggcaccgaatggcaatggctatctgacactgtatg

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком