ПРИБОРЫ И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА, 2014, № 1, с. 79-84
ОБЩАЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ТЕХНИКА
УДК 543.46
АВТОМАТИЗИРОВАННЫМ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫМ МИКРОСКОП ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ДИНАМИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
© 2014 г. Г. Г. Левин, Г. Н. Вишняков, В. Л. Минаев
ВНИИ оптико-физических измерений Россия, 119361, Москва, ул Озерная, 46 E-mail: levin@vniiofi.ru Поступила в редакцию 10.12.2012 г. После доработки 19.06.2013 г.
Описан автоматизированный интерференционный микроскоп, реализующий метод фазовых шагов в динамическом режиме при непрерывном движении зеркала опорного канала. Микроскоп предназначен для измерения высоты профиля поверхности отражающих нестационарных во времени (динамических) объектов с погрешностью до 0.3 нм, динамических процессов в живых клетках с частотой получения фазовых изображений до 30 Гц.
DOI: 10.7868/S0032816214010066
ВВЕДЕНИЕ
В последние десятилетия проявляется активный интерес к интерференционным измерениям в микроскопии, что связано в основном с высокой точностью таких измерений. Так, современные интерференционные микроскопы обеспечивают погрешность измерения профиля поверхности до 1 А.
Повышение точности интерференционных измерений обусловлено появлением современных методов и алгоритмов расшифровки интер-ферограмм, в первую очередь метода "фазового сдвига" или "фазовых шагов" (phase shifting methods) [1, 2]. Этот метод требует регистрации нескольких (от трех и более) интерферограмм при различной оптической длине пути излучения опорного канала. Существуют также методы расшифровки по одной интерферограмме — это метод "скелетизации" полос и метод, основанный на преобразовании Фурье интерферограмм в полосах конечной ширины [3, 4]. Эти методы менее точны, чем метод фазовых шагов, поэтому в данной работе они не рассматриваются.
В промышленности интерференционная микроскопия используется в основном для профило-метрии зеркально отражающих поверхностей [5, 6], измерения шероховатости [7], толщины покрытий объектов, показателя преломления в микрообъемах [8] и пр.
Интерференционная микроскопия также широко применяется в биологических исследованиях для изучения живых клеток, являющихся нестационарными (динамическими) фазовыми объектами [9—18]. Восстановленная из нескольких интерферограмм двумерная карта распределения оптической разности хода (далее фазовое изображение)
и ее изменение во времени несут важную информацию о структуре и динамических процессах в клетке.
Сложность оптических исследований динамических объектов заключается в необходимости уменьшения времени экспозиции при регистрации изображений объекта до такого значения, при котором можно считать объект неизменным, т.е. до так называемого времени "замороженно-сти" объекта. При интерференционных измерениях параметров динамических объектов ситуация усложняется тем, что за время "заморожен-ности" объекта необходимо зарегистрировать не одно, а несколько интерференционных изображений при различной оптической длине опорного канала.
Известны несколько моделей интерференционных микроскопов, которые позволяют исследовать динамические объекты. Один из них — цифровой голографический микроскоп фирмы Lyncee Tec SA (Швейцария), обеспечивающий запись и расшифровку низкочастотных голограмм в режиме 15 кадров/с [19]. Для цифровой реконструкции волнового фронта по голограмме используется преобразование Френеля. Этот метод подобен известному фурье-методу, используемому в оптической профилометрии [3]. Недостаток этого микроскопа заключается в невысокой точности реконструкции фазы по сравнению с методом фазовых шагов.
Известен также автоматизированный интерференционный микроскоп "Эйрискан", разработанный на базе микроинтерферометра МИИ-4 [14, 15]. Его отличительной особенностью является то, что интерференционное изображение регистрируется с помощью специального коорди-
Рис. 1. Циклограмма работы динамического микроскопа: а — напряжение на пьезоэлементе опорного зеркала; б — кадровые импульсы камеры; в — график фазовых сдвигов.
натно-чувствительного фотоприемника — диссектора. Этот прибор представляет собой электронно-оптический преобразователь с фотоэлектронным умножителем и магнитным переносом потока электронов в плоскость диафрагмы с малым отверстием. Время ввода одного пикселя 1 мс [14, 15]. Благодаря диссектору микроскоп позволяет проводить локальные динамические измерения в одной или нескольких точках фазового изображения динамического объекта. Однако время захвата полного кадра в зависимости от его размера варьируется от 5 с до 15 мин, что дает возможность исследовать лишь стационарные фазовые объекты.
Цель настоящей работы — разработка и экспериментальная апробация динамического интерференционного микроскопа, позволяющего захватывать интерференционные изображения динамических объектов и сдвигать фазу опорного канала со скоростью, достаточной для последующей реконструкции фазовых изображений, с временным разрешением 1/30 с, т.е. частотой до 30 Гц.
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
Для реконструкции фазового распределения динамического объекта был выбран упомянутый выше метод фазовых шагов. Для обеспечения высокой точности необходимо захватывать >10 интер-ферограмм [20]. Следовательно, для реконструкции серии фазовых изображений с временным интервалом 1/30 с частота захвата интерференционных изображений должна быть в 10 раз больше, т.е. со-
ставлять >300 кадров/с. Таким образом, время "замороженности" объекта должно быть >1/30 с.
Ранее нами был реализован автоматизированный интерференционный микроскоп с дискретным фазовым сдвигом, в котором опорное зеркало смещалось дискретными шагами с небольшой задержкой после каждого шага для уменьшения влияния колебательного процесса фазосдвигаю-щей системы [5]. Однако для динамической интерференционной микроскопии, которая должна обеспечивать более высокую скорость регистрации интерферограмм, такой старт-стопный режим движения зеркала не подходит, поэтому мы использовали непрерывное смещение опорного зеркала.
При непрерывно меняющейся фазе опорного канала интегрирование интенсивности света за время считывания кадра ведет лишь к понижению контраста интерференционных полос на величину порядка sine (к/2), где А — величина фазового сдвига. Например, при сдвиге фаз на я/2 произойдет снижение контраста на 10%, что вполне допустимо.
Метод фазовых шагов требует захвата N интер-ферограмм (N > 3) при различных значениях фазового сдвига Аф опорного зеркала. Для этого на пьезоэлемент, управляющий опорным зеркалом, подается напряжение треугольной формы амплитудой итр и частотойfw (рис. 1а) Интерференционные изображения захватываются камерой c частотой захвата/зах. Амплитуда напряжения итр вы-
АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫЙ МИКРОСКОП
81
бирается так, чтобы обеспечить перемещение Б зеркала, равное
Б =
N Лф^ 4п '
(1)
где X — длина волны излучения.
Конечным результатом работы прибора является получение серии фазовых изображений с частотой следования кадров /фи в течение определенного промежутка времени Т. В результате можно смонтировать фильм длительностью Т, с, со скоростью /фи кадров в секунду.
Захват набора из десяти интерференционных изображений происходит во время движения опорного зеркала в одну сторону, поэтому частота напряжения / электрического поля на пьезоэлементе определяется необходимой частотой получения фазовых изображений _/фи:
/тр = /фи/2. (2)
Частота захвата камеры /зях одного набора из десяти интерферограмм определяется как
/зах = /ф^. (3)
Частота реконструкции фазовых изображений связана с частотой захвата камеры (3). Следовательно, частота реконструкции фазовых изображений и ее погрешность, определяющие динамические характеристики микроскопа, напрямую определяются частотой и погрешностью частоты захвата камеры.
Зависимость между напряжением и сдвигом Б( ир зеркала опорного канала определяется конкретным типом пьезоэлемента и может носить нелинейный характер. Это приводит к непостоянству фазового сдвига Дф при постоянном изменении напряжения Ди. Поэтому в предлагаемом методе на первом этапе предусмотрено предварительное определение фазовых сдвигов между каждой парой интерференционных изображений (см. рис. 1). Для этого используется метод, основанный на фурье-преобразовании [20]. Фазовый сдвиг между интерферограммами определяется разностью аргументов значений комплексного числа в + 1-м (-1-м) порядке фурье-спектра интерферо-граммы. Этот метод накладывает ограничения на количество полос на интерферограмме, которое должно было достаточно большим, чтобы +1-й и -1-й порядки в фурье-плоскости были разделены. Полученные сдвиги используются для выделения пачек интерферограмм и реконструкции серии фазовых распределений.
Так как значения сдвигов при нарастании и спаде напряжения имеют разные знаки (см. рис. 1), то по всей совокупности сдвигов можно выделить разные наборы интерферограмм. Для этого задается два порога: Дф и —Дф. Если 1-е и (/ + 1)-е изображения, фазовый сдвиг между которыми
равен Дф(- = ф+1 — ф;, попадает в диапазон — Дф < < Дф; < Дф, то 1-е изображение не включают в набор.
На втором этапе зарегистрированные интерференционные изображения и полученные фазовые сдвиги используются для реконструкции фазовых изображений по методу фазовых шагов [20]. Интенсивность интерферограммы в любой ее точке должна меняться во времени по синусоидальному закону при непрерывном изменении фазы опорного канала. Мы регистрируем лишь 10 точек на этой "временной" синусоиде. Суть используемого нами алгоритма обработки одного набора интерферограмм заключается в нахождении методом наименьших квадратов параметров уравнения синусоиды, проходящей через эти 10 точек. Для этого в каждой точке измеряемого объекта по набору интерферограмм осуществляется минимизация функционала невязки. В общем случае функционал нелинеен, так как содержит неизвестные фазовые сдвиги как аргументы тригонометрических функций. Для линеаризации функционала невязки были использованы относительные фазовые сдвиги между интерфе-рограммами, найденные на первом этапе. В этом случае параметры минимизации входят в модель как линейные члены и легко определяются из сист
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.