ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 5, с. 534-538
^=МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.695:579.852.11:547.562.33312
Bacillus cereus - МИКРООРГАНИЗМ-ДЕСТРУКТОР 2,4-ДИХЛОРФЕНОЛА
© 2007 г. Г. Г. Матафонова*, Г. С. Ширапова*, C. Zimmer**, G.-W. Kohring**, F. Giffhorn**,
В. Б. Батоев*, В. Ж. Цыренов***
*Байкальский институт природопользования СО РАИ,
670047 Улан-Удэ, ул. Сахъяновой, 6 ** Institute for Applied Microbiology of Saarland University, Im Stadtwald, Geb. 2, 66123 Saarbrücken, Germany ***Восточно-Сибирский государственный технологический университет, 670013 Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 E-mail: ngal@binm.bsc.buryatia.ru Поступила в редакцию 27.10.2006 г.
На основании морфологических, физиологических признаков и анализа последовательности гена 16s рДНК впервые идентифицирован микроорганизм-деструктор 2,4-дихлорфенола как Bacillus cereus BIP507, выделенный из пруда-аэратора Байкальского целлюлозно-бумажного комбината. Установлена способность данного микроорганизма разлагать 2,4-дихлорфенол при его концентрации до 560 мкМ.
Полихлорированные фенолы (хлорфенолы) являются органическими загрязнителями природных и сточных вод, оказывающими токсическое действие на живые организмы. На Байкальском целлюлозно-бумажном комбинате (БЦБК) хлорфенолы образуются при хлорной отбелке целлюлозы и обнаруживаются в воде оз. Байкал, в зоне сброса очищенных сточных вод (Бейм и др., 1997; Батоев и др., 2005). Для интенсификации процессов биодеструкции хлорфенолов в системах очистки промышленных стоков БЦБК перспективно применение микроорганизмов-деструкторов пруда-аэратора бЦбК. Ранее при культивировании ила пруда-аэратора в минеральной среде с 2,4-дихлорфенолом (2,4-ДХФ) в качестве единственного источника углерода и энергии нами были выделены накопительные культуры микроорганизмов-деструкторов 2,4-ДХФ (Батоев и др., 2004). Для дальнейшего исследования была отобрана культура № 7, обладающая наибольшим деструктивным потенциалом по отношению к 2,4-ДХФ.
Цель настоящей работы - идентификация микроорганизма-деструктора 2,4-ДХФ и определение характеристик деструкции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Чистую культуру микроорганизма-деструктора 2,4-ДХФ выделили методом высева на агари-зованные среды, содержащие 2,4-ДХФ, хранили на мясопептонном агаре и использовали для изучения морфологических и физиологических при-
знаков по общепринятым методикам (Методы ..., 1983; Определитель ..., 1997).
Экстракцию и очистку ДНК осуществляли из клеток суточной культуры по стандартной фенол-хлороформной методике (Wimpee et al, 1991). Амплификацию гена 16s рДНК проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием универсальных праймеров фирмы "Invitrogen GmbH" (Германия) 16S27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') и 16S1525R (5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3') (Lane, 1991). Объем амплификационной смеси составлял 30 мкл и имел следующий состав: 100 нг матричной ДНК; 160 мкмолей дезоксирибонуклеозид-трифосфатов; 1 мкмоль каждого праймера; 3 мкл буферного раствора (mpuc-HCl, KCI, (NH4)2SO4, 15 ммолей MgSO4, альбумин бычьей сыворотки (BSA), Triton X-100; pH 8.7); 2 мкл диметилсуль-фоксида; 2.4 ммоля MgCl2; 0.5 единицы активности Гад-полимеразы ("Amersham Biosciences Europe GmbH", Германия); стерильная вода. После первоначальной денатурации проводили 25 циклов амплификации при следующих условиях: денатурация при 94°C 0.5 мин, отжиг праймеров при 65°C 0.5 мин, затем при 72°C 1 мин. ПЦР проводили на программируемом термоциклере ("Biometra", Германия). Продукт ПЦР выделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и mpuc-борат-ном буфере при напряженности поля 4.4 В/см в течение 1.5 ч с последующим окрашиванием бромистым этидием и фотографировали. Амплифи-цированные фрагменты генов 16s рДНК были встроены в плазмидный вектор pCR®II-TOPO ("Invitrogen GmbH") и клонированы в компетент-
ных клетках Escherichia coli с помощью набора TOPO TA Cloning® ("Invitrogen GmbH"). После отбора трансформированных клеток (клонов) методом "бело-голубого" скрининга на канамицин-содержащей среде, рекомбинантная плазмидная ДНК была подвергнута ПЦР-амплификации с последующим гель-электрофорезом. Секвенирова-ние последовательностей клонированных ампли-фикатов проводили на автоматическом секвенато-ре DNA Sequencer 373 ("Applied Biosystems 373", США) с помощью набора реактивов Thermo Seque-nase Primer Cycle Sequencing Kit ("Amersham Biosciences Europe GmbH"), внешних праймеров (M13univCS-5'-AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT-3', M13revCS-5'-GAGCGGATAACAATTTCACA-CAGG-3') и одного внутреннего праймера (DiHo-1100-r-GGGTTGCGCTCGTTG). Полученная в результате секвенирования нуклеотидная последовательность гена 16s рДНК исследуемых микроорганизмов была проанализирована путем ее сравнения с имеющимися в GenBank последовательностями с помощью программы BLAST, расположенной на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI, США). Опыты по исследованию деструкции 2,4-ДXФ осуществляли путем культивирования микроорганизма при 28°С на круговой качалке (143 об./мин) в среде следующего состава, г/л: K2HPO4 0.65; KH2PO4 0.19; NaNO3 0.5; MgSO4 ■ 7H2O 0.1; FeSO4 ■ 7H2O 0.00556; (NH4)2SO4 0.5; дрожжевой экстракт 0.5 и 2,4-ДXФ в концентрации 20, 160, 200, 385 и 560 мкМ (Loh, Wang, 1998). В среде, не содержащей бактерии (контрольный опыт), концентрация 2,4-ДXФ составила 70 мкМ. Содержание 2,4-ДXФ в культуральной жидкости определяли после отделения клеток центрифугированием (10 мин, 13000 g) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детекцией при 285 нм ("Beckman", США). Использована колонка С-18 (125 x 3 мм, 5 мкм), подвижная фаза 60% метанола, 2.5% уксусной кислоты, вода; скорость элюирования 0.5 мл/мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Микроорганизм-деструктор 2,4-ДХФ (штамм № 7) представляет собой грамположительные спорообразующие бактерии-палочки длиной 1.94.0 мкм. Бактерии каталазоположительные, обладают редуцирующей способностью, не разжижают желатин, выделяют сероводород, не образуют аммиак и индол, утилизируют в качестве источников углерода глюкозу, сахарозу, лактозу и маннит.
Из клеток односуточной культуры была выделена и амплифицирована геномная ДНК. Ампли-фикаты клонированы и секвенированием определены нуклеотидные последовательности вставок, содержащих ген 16s рДНК. На основании резуль-
M 123456789 10 M
2000 п.н. -1500 п.н. -1000 п.н.
M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
Рис. 1. Электрофореграмма клонированных ампли-фикатов, 1-20 - клоны, М - маркер молекулярной массы ДНК 1000 п. н. ("Gene Ruler"). Стрелками указаны клоны, отобранные для секвенирования.
татов ПЦР-анализа плазмидной ДНК полученных клонов были отобраны три препарата, несущих исследуемую вставку - 8, 9, 10 (рис. 1). По структуре исследованного фрагмента рДНК (1545 пар нуклеотидов (п. н.)) бактерии-деструкторы 2,4-ДХФ могут быть отнесены к трем близкородственным видам Bacillus при одинаковом проценте гомологии 99% с типовыми штаммами (табл. 1). Как известно, бактерии рода Bacillus по нуклеотидной последовательности 16s рРНК разделены на пять групп, первая из которых включает виды B. thuringiensis, B. anthracis, B. cereus и B. mycoides (Henderson et al., 1995). Для генотипи-ческой идентификации таких близкородственных микроорганизмов на уровне вида, штамма или внутривидовой субпопуляции разработаны различные методы: SSCP (Borin et al., 1997), DIR-PCR (Цыганкова и др., 2004), RAPD-PCR (Henderson et al., 1995; Ronimus et al., 1997), RSI-PCR (Daffon-chio et al., 1999), RFLP, AP-PCR, DAF-PCR, AFLP (Micheli, Bova, 1997). В частности, метод DIR-PCR применяется для идентификации фенотипиче-ских диссоциантов B. cereus и B. subtilis (Цыганкова и др., 2004). В данной работе для идентификации на уровне вида была проведена дополнительная ПЦР-амплификация ДНК-матрицы с использованием олигонуклеотидных праймеров,
536
МАТАФОНОВА и др.
Таблица 1. Результаты идентификации микроорганизма-деструктора 2,4-ДХФ после секвенирования по фрагменту рДНК 1545 п. н.
Гомология
Штамм % соотношение длин совпавших фрагментов, п. н.
B. thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 99 1535/1545
B. anthracis str. Ames 99 1534/1545
B. cereus ATCC 14579 99 1534/1545
B. cereus ZK 99 1534/1545
соответствующих генам вирулентности B. anthra-cis (Ramisse et al, 1996) (табл. 2). Проведенная нами амплификация дала отрицательный результат в отношении этого вида. Дополнительно были проведены биохимические тесты на цитохромок-сидазу и деструкцию сукцината. На основании отрицательных реакций тестов и колониальномор-фологических характеристик микроорганизм-деструктор 2,4-ДХФ идентифицирован как Bacillus cereus с лабораторным номером BIP507.
Далее исследованы некоторые характеристики деструкции 2,4-ДХФ, осуществляемой исследуемым микроорганизмом. Установлено, что деструкция токсиканта осуществлялась при концентрациях 2,4-ДХФ до 560 мкМ (рис. 2). После 2 сут культивирования бактерии утилизировали 77.6, 64.9 и 56.0% субстрата при исходной концентрации 20, 160 и 200 мкМ 2,4-ДХФ соответственно. В контрольном опыте концентрация 2,4-ДХФ изменилась незначительно. Скорости деструкции 2,4-ДХФ микроорганизмом B. cereus BIP507 по соотношению остаточной (С) и исходной концентраций (С0) субстрата были сопоставлены с найденными ранее для B. insolitus (Wang et al., 2000) в максимально близком диапазоне использованных концентраций 2,4-ДХФ. После 9 сут культивирования B. cereus BIP507 в минеральной среде с 2,4-ДХФ при концентрации 160 и 385 мкМ получено С/С0 < 0.2, в то время как в случае с B. insolitus С/С0 > 0.6 (рис. 3). Очевидно, что при концентрациях 2,4-ДХФ до 560 мкМ B. cereus BIP507 обладает большей деструктивной способностью, чем B. insolitus. Имеющиеся в литературе сведения о деструкции хлорфенолов другими видами Bacillus sp. немногочисленны и относятся, главным образом, к термофильным микроорганизмам. Например, штамм Bacillus sp. A2 способен утилизировать 2-хлорфенол при температуре
Таблица 2. Структура и позиции праймеров, использованные в ПЦР с рДНК микроорганизма-деструктора 2,4-ДХФ
Праймер Позиция, п. н. Длина фрагмента, п. н. Структура праймера (направление 5'—»3')
67 19
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.