ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 5, с. 443-452
УДК: 579.234+579.222+579.61
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ МЕМБРАННЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ НАНОВЕЗИКУЛЫ: СТРОЕНИЕ, БИОГЕНЕЗ, ФУНКЦИИ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ (ОБЗОР)
© 2015 г. К. А. Луста
Научно исследовательский институт морфологии человека РАМН, Москва 117418 Институт атеросклероза (Сколково), Москва 121609 e-mail: k_lusta@rambler.ru Поступила в редакцию 7.11.2014 г.
В обзоре рассматриваются нановезикулы различных типов бактерий, их строение и состав, биогенез, механизмы секреции, условия образования и выделения, функции, участие в патогенезе, а также использование в биотехнологии и медицине.
Ключевые слова: внеклеточные мембранные нановезикулы, наружная мембрана бактерий, секреция, биогенез, межвидовые коммуникации, межклеточные сигналы, токсины бактерий, модулирование иммунитета, вакцины.
БО1: 10.7868/80555109915040091
В последние два десятилетия показано, что некоторые бактерии выделяют со своей поверхности в окружающую среду внеклеточные мембранные нановезикулы (ВМН), ограниченные мембраной бактерий и содержащие внутри компоненты периплазмы [1—4]. Впервые ВМН были обнаружены, когда было замечено, что бесклеточный суперна-тант культуры E. coli, выращенной в условиях лимитирования роста по лизину, содержал растворимые липополисахариды (ЛПС). Авторы предположили, что в этих условиях у бактерий ингибируется синтез пептидогликана, не затрагивая при этом синтез наружной мембраны (НМ). В результате, избыток НМ не может оставаться связанным с клеткой [5]. Электронно-микроскопическое исследование этих бактерий показало, что, действительно, от внешней оболочки клеток отделялись небольшие сферические структуры с электронно-плотным центром, окруженным одной мембраной [6, 7]. Однако в последующих исследованиях было установлено, что ВМН формировались также и в нормальных условиях роста бактерий как in vitro, так и in vivo в инфицированных тканях хозяина, и что ВМН образуются многими видами грамотрицательных бактерий, что указывает на естественную природу процесса и его широкое распространение среди микроорганизмов [8, 9]. Все грамотрицательные бактерии, исследованные к настоящему времени (как патогенные, так и непатогенные), на всех этапах их роста естественным образом продуцируют ВМН [8, 10]. Использование метода подсчета радиоактивно меченого белка и токсинов показало, что нативные ВМН, проду-
цируемые клетками бактерий, составляют значительную фракцию клеточного материала, достигающую 12% [11]. В сооставе ВМН присутствуют в основном компоненты наружной мембраны гра-мотрицательных бактерий, включающие ЛПС, глицерофосфолипиды, белки НМ бактерий, а также элементы периплазмы и цитоплазмы [1, 12, 13]. Кроме того, показано, что в ВМН содержится плазмидная и хромосомная ДНК и ДНК бактериофагов [14—17]. Ранее было установлено, что эти везикулы обладают рядом биологических свойств, в том числе способностью к адгезии к поверхности клеток про- и эукариот [18]. Получены достоверные экспериментальные доказательства, свидетельствующие, что ВМН, выделяемые патогенными бактериями, содержат факторы вирулентности. Предполагается, что они являются средствами доставки патогенных факторов в ткани эукариот.
Исследования плотности и состава ЛПС, а также анализ белков изолированных ВМН показали, что в них отсутствуют или могут содержатся следовые количества компонентов внутренней мембраны (ВМ) и цитоплазмы бактерий [19]. Это свидетельствует о том, что ВМН образуются не в результате лизиса клеток, когда появляются везикулы, содержащие смесь белков и липидов, выделенных из всех фракций клетки. Продуцируемые бактериями ВМН содержат биологически активные белки и осуществляют разнообразные функции. В отличие от других механизмов секреции ВМН позволяют бактериям выделять комлексы нерастворимых и растворимых соединений. Выделяемые ферменты могут использоваться, до-
стигая отдаленных объектов в концентрированном и защищенном виде. Образование ВМН является реакцией бактерий на стресс, что позволяет им играть важную роль в выживаемости бактерий, их питании, развитии биопленок и патогенезе [9].
ВМН примененяются в качестве вакцинных носителей для иммунизации человека и животных против многих инфекционных заболеваний. В настоящее время изучается возможность использования этих наночастиц в других областях биотехнологии.
Биогенез ВМН. В процессе эволюции микроорганизмы адаптировались к условиям окружающей среды обитания (вода, почва и организм хозяина), включая такие экстремальные, как гидротермальные источники. Микробы вырабатывают конкретные приспособления, обеспечивающие взаимодействие с окружающей средой. Одним из них является выделение ВМН прокариотами [20]. Несмотря на широкий диапазон бактерий, у которых были обнаружены ВМН, и на то, что эти везикулы участвуют во многих важных биологических процессах, о молекулярном механизме их формирования известно недостаточно [9].
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из внутренней и наружной мембраны, разделенных периплазмой и слоем пептидо-гликана. НМ связана липопротеином с подлежащим слоем пептидогликана. В состав НМ входят фосфолипиды, ЛПС, интегральные мембранные белки и липопротеины. Основным компонентом является двойной липидный слой. Внутренний слой НМ представлен фосфолипидами, а наружный — ЛПС. ВМ и НМ различаются по липидно-му и белковому составу [21]. Толщина периплаз-матического пространства между двумя мембранами (~13 нм) составляет 7—40% от общего объема клетки [22]. НМ содержит большое количество белков и выполняет функции снабжения клетки питательными веществами, прикрепления к поверхностям, секреции, сигнализации и защиты от окружающей среды [23, 24]. Помимо известных и изученных шести типов секреции мультибелковых комплексов из клетки выделение ВМН бактериями является еще одним типом секреции [25].
Биогенез ВМН включает выпячивание НМ бактерий в области, где отсутствуют связи мембраны с пептидогликанами, регулирование образования везикул без потери целостности НМ, насыщение ВМН различными компонентами или исключение определенных белков и липидов, а также деление мембран без энергии АТФ/ГТФ гидролиза [9, 26, 27].
Механизм образования ВМН и их отделения от клетки не выяснен полностью, но на основании генетических и биохимических исследований показано, что формирование ВМН является
одной из основных характеристик роста грамотрицательных бактерий и в этот процесс вовлечено множество факторов [28—31].
Предложены три модели формирования этих везикул и выделены пять гипотетических факторов, способствующих биогенезу внеклеточных везикул [32, 33]. ВМН образуются в местах отсутствия связи между наружной мембраной и пептидогликанами [31]. Формированию ВМН способствует взаимное отталкивание анионно заряженных соседних молекул ЛПС на поверхности клеток [33, 34]. Образование ВМН индуцирует накопление посторонних соединений в периплазме [29, 35, 36]. ВМН формируются на участках с повышенной ригидностью мембраны [34, 37]. Выделение ВМН происходит на участках с повышенной кривизной мембраны [31].
У всех бактерий выработана сложная коммуникационная стратегия кворум-сенсинга (QS) для координации их деятельности. Этот механизм используется при патогенезе. В этой системе основную роль играет сигнальная молекула 2-гептил-3-гидрокси-4-хинолон (PQS Pseudomonas quinolone signal), которая транспортируется окружающим клеткам с помощью ВМН. Эти молекулы играют как роль сигналов, так и участвуют в формировании ВМН. Было показано, что PQS взаимодействуют с ацильными цепями и 4'-фосфатом бактериального ЛПС и стимулируют образование структур подобных липосомам — очищенных ЛПС. Эти исследования показывают, что кворум-сигналы выполняют не только сигнальную функцию, но и участвуют в биогенезе ВМН [34, 38].
Воздействие внешних факторов и стресса на образование ВМН. Известно, что образование ВМН бактериями усиливается под воздействием различных факторов [39], в частности температуры [19], антибиотиков [36, 40] и кислородного стресса [41]. Так, например, обнаружено, что формирование везикул у бактерий Serratia marcescens является терморегулируемым. При 22—30°С образовывалось значительное количество ВМН, тогда как при 37°С их было гораздо меньше [42]. Существует гипотеза, что формирование ВМН значительно усиливается в ответ на стресс (сигналы SOS). К таким выводам привели в частности наблюдения, что при подавлении бактериальных инфекций антибиотиками у бактерий индуцируется ответ SOS и образование ими ВМН. Для проверки этой гипотезы исследовали образование ВМН бактериями Pseudomonas aeruginosa дикого типа и мутантным штаммом lexAN, в котором SOS-ответ подавлялся при воздействии ципро-флоксацина. Содержание белков, липидов, а также цитотоксичность ВМН для клеток-хозяев увеличивались для обоих штаммов при обработке антибиотиками. Дальнейшее увеличение продукции ВМН у lexAN штамма было подавлено, что предполагает участие SOS в этом процессе. Таким
образом, ответ на стресс играет важную роль в стимуляции образования ВМН и способствует цитотоксичности бактерий [43]. Существенное влияние на их образование оказывает также присутствие микроэлементов в среде обитания бактерий [44, 45].
Состав ВМН. Установлено, что ВМН состоят главным образом из типичных, широко распространенных белков НМ [46] и периплазматиче-ских белков [47]. Кроме того, ВМН обогащены, как некоторыми определенными белками, так и липидами, тогда как другие полностью исключены [12, 46, 48, 49]. Так, например, ВМН бактерий P. aeruginosa содержали только ЛПС B-группы, которые присутствуют в ВМ этих бактерий в минимальном количестве [47, 49]. Эти исследования указывают на то, что образование ВМН является результатом биологического процесса.
Протеомный анализ ВМН, выделяемых различными видами бактерий, показал, что изолированные везикулы содержат более ста различных белков. Среди них обнаружены такие белки НМ бактерий, как предшественник липопротеи-на AcfD, белок рецептора внешней мембраны TolC, предшественник феррихромного белка, антиген НМ, предшественник фосфолипазы A1, кана
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.