Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2013, том 39, № 1, с. 121-128
УДК 579.222.3
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПИГМЕНТ ПРОДИГИОЗИН И ЕГО ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
© 2013 г. И. Д. Гурьянов*, #, Н. С. Карамова**, Д. В. Юсупова**, О. И. Гнездилов***, Л. А. Кошкарова**
*Казанский национальный исследовательский технологический университет 420015, Казань, ул. К. Маркса, 68 **Казанский (приволжский) федеральный университет, Казань ***Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань Поступила в редакцию 11.01.2012 г. Принята к печати 31.01.2012 г.
Из биомассы бактерий Serratia marcescens АТСС 9986 выделен пигментный комплекс,который с применением хроматографических методов разделен на отдельные фракции. Анализ фракций спек-трофотометрическим методом, тонкослойной хроматографией, ЯМР- и масс-спектрометрией позволил выделить из комплекса так называемую "красную фракцию", подтвердить идентичность продукта красной фракции пигменту продигиозину и доказать его чистоту. Установлены особенности токсического действия продигиозина. Впервые определена возможность индукции пигментом мутаций в клетках Salmonella typhimurium TA 100 (тест Эймса) и хромосомных повреждений эритробластов млекопитающих.
Ключевые слова: Serratia marcescens АТСС 9986, продигиозин, токсическое и генотоксическое действие. DOI: 10.7868/S0132342312060048
ВВЕДЕНИЕ
Ярко-красный пигмент продигиозин, синтезируемый энтеробактериями Serratia marcescens, представляет собой линейный трипиррол (пиррол, 3-метоксипиррол, 2-метил-3-амилпиррол) [1].
Как и многие вторичные метаболиты бактерий, продигиозин в последнее время приобретает практическое значение: он применяется в промышленности как краситель для полимеров [2], разработан способ использования продигиозина в качестве маркера нефтепродуктов [3]. Продиги-озин и продигиозинподобные пигменты, синтезируемые некоторыми видами микроорганизмов, рассматриваются как новое семейство противоопухолевых лекарственных препаратов [4, 5]. Про-
Сокращения: НПК — неочищенный пигментный комплекс; НХЭ — нормохромные эритроциты; ПХЭ — поли-хромные эритроциты. #Автор для связи (тел.: (843) 515-32-00; эл. почта: igurjano.27@mail.ru).
дигиозин действует также как иммунодепрессант, селективно блокируя пролиферацию Т-клеток киллеров [6].
В связи с использованием продигиозина в фармацевтике (Sigma-Aldrich, CAS Number: 56144-17-3) возникает необходимость изучения его геноток-сических свойств.
Целью данной работы являлось получение вы-сокоочищенного препарата продигиозина и исследование его генотоксических и токсических свойств.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что в кислой и нейтральной средах продигиозин имеет красную окраску, с резко выраженным спектральным максимумом поглощения при длине волны 535—540 нм. В щелочной среде пигмент окрашивается в оранжево-желтый цвет; при этом его спектр поглощения характеризуется более широким пиком с максимумом при длине волны 470 нм [1].
Неочищенный пигментный комплекс (НПК), растворенный в этаноле, имел типичный для продигиозина спектр поглощения в видимой области в кислых и щелочных условиях (рис. 1). На колон-
нм
Рис. 1. Оптические спектры поглощения неочищенного пигментного препарата в этаноле при рН 3.0 (1)и рН 9.0 (2).
ке с силикагелем данный комплекс делился на три основные фракции: желто-оранжевую, красную и сиреневую, оптические спектры поглощения которых представлены на рис. 2.
Таблица 1. Данные ЯМР-спектров (8, м.д.) продигио-зина, полученные в данной работе и представленные в литературе
Пигмент М 323.5 Да [7] Пигмент М 323 Да [8] Пигмент М 322.9 Да Данное исследование
12.44 - -
12.54 - -
- - 7.55
7.23 7.26 7.27
6.95 6.99 6.99
6.92 6.95 -
6.69 6.71 6.68
6.35 6.39 6.35
6.08 6.11 6.08
4.01 4.04 4.00
2.76 2.58 2.55
2.39 2.44 2.40
1.53 1.59 1.60
1.30 1.34 1.33
1.32 1.31 1.31
0.89 0.93 0.92
Для проведения дальнейшей очистки с использованием препаративной ТСХ была отобрана красная фракция, которая на пластинках с силикагелем также разделялась на три вышеуказанные фракции (сиреневая — ^0.058, красная — ^0.312, желто-оранжевая — 0.824; элюент — гексан-эти-ловый эфир-уксусная кислота, 70 : 30 : 1).
Согласно результатам спектрофотометрии, красная фракция пигментного комплекса наиболее соответствовала продигиозину. Она была выделена методом препаративной ТСХ и проанализирована с использованием методов ТСХ, масс-спектрометрии (рис. 3) и ЯМР-спектроскопии (рис. 4). Молекулярная масса выделенной красной фракции, определенная методом масс-спек-трометрии, составила величину 322.9 Да, что соответствует молекулярной массе продигиозина (С20И25М30) [1, 4]. Сопоставление сигналов ЯМР-спектра продукта красной фракции с таковыми для продигиозина, представленными в литературе [7, 8], указывает на его соответствие данному пигменту (табл. 1).
Проявление хроматограмм НПК и его красной фракции после опрыскивания раствором нингид-рина, реактивом Драгендорфа, раствором родамина В и экспозиции в йодной камере показало наличие фосфатидов, и в частности аминофосфа-тидов, в НПК и их отсутствие в пигментном образце (красной фракции), прошедшем все этапы очистки.
Рис. 2. Оптические спектры поглощения фракций, полученных при хроматографии неочищенного пигментного препарата на колонке: желто-оранжевой (а), красной, с максимумом поглощения 535 нм и плечом 485—515 нм (б), сиреневой, с максимумом поглощения 488—500 нм (в).
Таким образом, с применением методов колоночной и тонкослойной хроматографии мы получили высокоочищенный препарат продигиозина, чистота которого была подтверждена методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.
Токсический эффект продигиозина определяли по выживанию обработанного им тестерного
штамма S. typhimurium TA 100 в опытных вариантах по сравнению с контрольным (в отсутствие продигиозина). Продигиозин обладал сильным токсическим действием по отношению к тестер-ному штамму в концентрациях 1.0 мкг/мл и выше. Эти данные были учтены при изучении гено-токсичности продигиозина.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
39.9 /
322.9
148.9
83
■ И> ,
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
550 ш/г
Рис. 3. Масс-спектр красной фракции пигмента.
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 м.д.
Рис. 4. ЯМР-спектр очищенного пигментного препарата, 5, м.д.: 0.92, 1.31, 1.33, 1.60, 2.40, 2.55, 4.00, 6.08, 6.35, 6.68, 6.99, 7.27, 7.55.
Мутагенность продигиозина оценивали по превышению количества колоний-ревертантов в опыте (с добавлением исследуемого соединения) над контролем (без внесения исследуемого соединения). Сущность теста Эймса заключается в том, что тестерные штаммы бактерий Б. typhiшuri-иш культивируют на специальной среде, на которой могут расти лишь мутанты этих штаммов, у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Без внешних воздействий такие мутации происходят с низкой частотой. Если в среду культивирования ввести химический мутаген, то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний. Для выявления возможных транс -формаций мутагена в организме млекопитающих использовали метаболическую активацию с при-
менением микросомной фракции печени 89. Учет результатов проводили по индукции обратных мутаций к гистидиновой прототрофности через 48 ч инкубации, сравнивая число колоний-ревер-тантов в опыте и контроле. Использовали следующую систему оценки соединений на мутагенную активность: если число колоний-ревертан-тов в опыте и контроле достоверно различалось менее чем в 2.5 раза, то делали заключение об отсутствии мутагенной активности; если фиксировали превышение от 2.5 до 10 раз, то делали заключение о наличии мутагенной активности. Превышение от 10 до 100 раз свидетельствовало о средней мутагенной активности исследуемого соединения. Если фиксировали превышение более чем в 100 раз, — вещество обладает сильной мутагенной активностью [9].
Таблица 2. Мутагенное действие НПК и чистого продигиозина в различных концентрациях в тесте Эймса
Число колоний-ревертантов
Концентрация НПК/продигиозина, мкг/мл среды
С метаболической активацией Без метаболической активации
Чистый продигиозин НПК Чистый продигиозин НПК
0 11 ± 1.7 6 ± 0.6
0.05 13.2 ± 1.8 33.75 ± 3.1 8.4 ± 0.9 18.0 ± 2.1
0.1 16.0 ± 2.1 45.32 ± 4.3 7.3 ± 0.76 27.0 ± 3.2
0.5 13.0 ± 1.9 53.17 ± 5.2 5.8 ± 0.58 34.5 ± 4.3
NaN3* 206 ± 8.0 98.6 ± 7.5
* NaN3 использовали в качестве позитивного контроля в концентрации 10 мкг/чашку.
Для НПК в тесте Эймса без метаболической активации превышение колоний-ревертантов в опыте над контролем составило 5.25, 4.5 и 3.0 раза при концентрации продигиозина 0.5, 0.1 и 0.05 мкг/мл соответственно. В варианте опыта с метаболической активацией количество ревертантов на среде с 0.5, 0.1 и 0.05 мкг/мл НПК превышало контрольный уровень в 4.8, 4.12 и 3.1 раза соответственно (табл. 2). Обнаруженный эффект носит дозозависимый характер, однако он незначителен и свидетельствует о слабой мутагенной активности соединения [9].
Мутагенный эффект чистого продигиозина снижался до уровня фоновой частоты реверсий в негативном контроле, то есть проявляемый гено-токсический потенциал НПК, вероятно, связан с загрязняющими компонентами, присутствующими в НПК, способными вызывать реверсию микроорганизмов опытного штамма к прото-трофности.
Метаболическая активация пигментных препаратов при использовании фракции 89 не приводила к усилению мутагенного эффекта в тесте Эймса. Возможно, система монооксигеназ фракции 89 не способна трансформировать такое соединение, как продигиозин, либо интермедиаты, образующиеся при его метаболизме, не отличаются по степени своей генотоксичности от исходного соединения. Таким образом, тест Эймса показал слабую мутагенную активность чистого продигио-зина в ряду концентраций 0.5—0.1—0.05 мкг/мл. Очищенный продигиозин не проявил мутагенной активности во всех вариантах опыта (табл. 2).
Наиболее распространенным методом изучения генотоксического потенциала соединений in vivo является учет количества микроядер в по-лихромных эритроцитах периферической крови мышей. Анализ 1350
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.