МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 3, с. 369-378
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.222.2:579.844
БАКТЕРИИ АКТИВНОГО ИЛА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОЧИСТНЫХ СООРУЖЕНИЙ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ЦИАНОПИРИДИНЫ И АМИДЫ ПИРИДИНКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
© 2015 г. В. А. Демаков*, **, Д. М. Васильев*, Ю. Г. Максимова*, Ю. А. Павлова*, **, Г. В. Овечкина*, А. Ю. Максимов*, **
*Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского Отделения Российской академии наук, Пермь **ГБОУВПО Пермский национальный исследовательский университет Поступила в редакцию 28.03.2014 г.
Исследовано видовое разнообразие бактерий активного ила биологических очистных сооружений (БОС) г. Перми, трансформирующих цианопиридины и амиды пиридинкарбоновых кислот. Методом накопительных культур на минеральной среде с 3-цианопиридином как единственным источником углерода и азота выделены 32 клона грамотрицательных гетеротрофных бактерий, дающих умеренный рост при пересевах на жидкой и плотной синтетической минеральной среде с 3- и 4-цианопиридином. По результатам анализа секвенированых фрагментов гена 16S рРНК клоны с не менее, чем 99% гомологией отнесены к родам Acinetobacter, Alcaligenes, Delftia, Ochrobactrum, Pseudomonas, Stenotro-phomonas, Xanthobacter. Посредством ПЦР анализа было выявлено, что 13 из 32 изолятов имеют последовательности размером около 1070 п.н., гомологичные генам нитрилаз, ранее обнаруженным у Alcaligenes faecalis JM3 (GenBank, D13419.1). Способность трансформировать нитрилы и амиды при росте на минимальной солевой среде обнаружена у 9 клонов; Acinetobacter sp. 11h и Alcaligenes sp. osv трансформировали 3-цианопиридин до никотинамида, а подавляющее большинство клонов обладали амидазной активностью, которая составляла от 0.5 до 46.3 ммоль/г ч по ацетамиду и от 0.1 до 5.6 ммоль/г ч по никотинамиду. Подтверждена утилизация никотинамида штаммом A. faecalis 2, сопровождающаяся выделением в среду вторичного метаболита, с вероятностью 91% идентифицированного как додецил акрилат.
Ключевые слова: нитрилутилизирующие бактерии, цианопиридины, амиды пиридинкарбоновых кислот, активный ил, нитрилаза, амидаза.
DOI: 10.7868/S0026365615030039
Основой биологической очистки сточных вод является аэробная и/или анаэробная деградация и минерализация органических веществ микроорганизмами [1, 2]. Активный ил биологических очистных сооружений, осуществляющий в аэро-тенках процесс очистки сточных вод в аэробных условиях, представляет собой сообщество микроорганизмов различных систематических групп, сосуществующих с некоторыми многоклеточными животными. Подвергаясь постоянному воздействию высоких концентраций органических соединений, токсичных веществ и тяжелых металлов в сточных водах, в результате естественной селекции развиваются и накапливаются микроорганизмы, обладающие высоким биодеграда-тивным потенциалом.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: maks@iegm.ru).
Нитрильные соединения широко распространены в природе, главным образом, присутствуют в растениях в виде цианогликозидов, а также ци-анолипидов, цианоалкалоидов, рицина, фенил-ацето нитрила и др. Более 2000 видов растений накапливают цианогликозиды в семенах, корнях и листьях, а также секретируют нитрильные метаболиты в виде основного компонента экссудата ризосферы корней. Вероятно, этот процесс влияет на эволюцию и распространение микроорганизмов, способных к ассимиляции нитрилов [3]. Кроме того, химическая промышленность широко использует различные органические нитрилы для производства ряда полимеров, химикатов и фармпрепаратов. Многие нитрилы очень токсичны, обладают мутагенным и канцерогенным действием, инактивируют респираторную систему, связываясь с цитохром с оксидазой. Микробная деградация является эффективным способом удаления высокотоксичных нитрилов из окружаю-
щей среды [4], кроме того, способность к гидролизу нитрилов может быть использована для целей биокаталитического синтеза важных в химической и фармацевтической промышленности соединений [5, 6].
Трансформация нитрилов микроорганизмами может происходить двумя различными ферментативными путями: 1) одностадийный гидролиз нитрилов до соответствующих карбоновых кислот и аммония с помощью фермента нитрилазы (КФ 3.5.5.1); 2) двустадийный катаболизм нитрилов, заключающийся в том, что нитрилы гидрати-руются до амидов нитрилгидратазой (КФ 4.2.1.84) и затем трансформируются до карбоновых кислот и аммония амидазой (КФ 3.5.1.4) [7]. Микроорганизмы, утилизирующие нитрилы, были обнаружены среди представителей разных систематических групп, в частности, способность к гидролизу ароматических нитрилов встречается у представителей родов актино- и протеобактерий Rhodococcus, Nocardia, Agrobacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter и др. [5, 8], а также грибов Fusarium, Aspergillus, Giberella, Penicillum [9].
Изучение нитрилгидролизующих бактерий направлено, главным образом, на всестороннюю характеристику штаммов, обладающих биотехнологическим потенциалом, регуляцию биосинтеза ферментов биодеградации, подбор условий культивирования [10—13]. Недостаточно внимания уделяется экологическим аспектам: работы, посвященные распространению нитрилутилизиру-ющих микроорганизмов, единичны [14] и не затрагивают такую важную часть водной экосистемы, образующуюся на стыке хозяйственной деятельности человека и природной среды, как аэробный активный ил.
Цель работы заключалась в изучении биологического разнообразия и нитрил- и амидтрансформи-рующей способности грамотрицательных бактерий, выделенных из активного ила биологических очистных сооружений на среде с 3-цианопиридином.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования были пробы активного ила, отобранные из аэротенков биологических очистных сооружений коммунальных стоков г. Перми (ООО "Новогор-Прикамье") в июне 2011г.
Накопительные культуры нитрилгидролизую-щих бактерий получали на минеральной безазотистой среде следующего состава (г/л): КН2РО4 — 1.0, К2НРО4 • 3Н2О - 3.7, NaCl - 0.5, MgSO4 • 7Н2О - 0.5, FeSO4 • 7Н2О - 0.005, CoCl2 • 6Н2О - 0.01, рН 7.2-7.4 с 3-цианопиридином в качестве единственного источника углерода и азота в конечной концентрации 10-50 мМ. В среду вносили активный ил в
соотношении 2 мл на 50 мл среды культивирования. Накопительные культуры инкубировали при температуре 30°С на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин в течение 14 сут и затем высевали на агаризованную синтетическую среду вышеприведенного состава и культивировали в термостате при 30°С. Пассажи проводили не менее трех раз.
Идентификацию изолятов проводили на основании культурально-морфологических, биохимических и хемотаксономических характеристик согласно определителю бактерий Берджи (окраска по Граму, морфология клеток и колоний, подвижность, тесты на наличие каталазы, оксидазы, рост на сахарах). Окончательная видовая идентификация была проведена путем ПЦР-анализа с прай-мерами к генам 16S рРНК, сконструированными на основе последовательностей, представленных в базе данных GenBank и синтезированными ООО "Евроген", г. Москва.
Препараты хромосомной ДНК получали фе-нольным методом [15].
Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Тод-полимеразы производства ООО "СибЭнзим" (Новосибирск) на тер-моциклере Т3 ("Biometra", Германия). Олигонук-леотидные праймеры, специфичные к ДНК генов известных нитрилаз были разработаны в соответствии с последовательностями 5' и 3'-концов генов нитрилаз грамотрицательных бактерий, имеющихся в базе данных GenBank (табл. 1).
Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР-реакции проводили в 1.2—1.5% агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности поля 5 В/см. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры 1 kb и 100 b (ООО "СибЭнзим" и Axi-gen®). Визуализацию полос и документирование данных осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze ("Biometra", Германия).
Очистку ПЦР-продукта перед секвенировани-ем осуществляли двумя способами: с использованием смеси ферментов ExoSAPMix (Fermentas Life Sciences) и с помощью аппарата E-Gel ("In-vitrogen", США) согласно инструкции фирмы-производителя.
Секвенирование проводили на приборе Genetic Analyzer 3500xl ("Applied Biosystems", США), следуя инструкциям фирмы-производителя.
Гомологию полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и нитрилаз с известными генами микроорганизмов анализировали с использованием программного пакета BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi) ; программы Chromas lite 2.1. Сравнение нуклеотидных
Таблица 1. Праймеры для амплификации генов нитрилаз
Название праймера 5'—3' последовательность Специфичность
NPF EBC-F GAAATTCCATATGACGGTGCATAAAAAACAG Нитрилаза Pseudomonas fluorescens EBC
NPF EBC-R CGGGATCCCTTGTCGCCTTGCTCTTCT (AY885240.1)
NPF 5-F TTGGATCCATGCCCAAGTCCGTTG Нитрилаза Pseudomonas fluorescens Pf-5
NPF 5-R TATAAGCTTGGTAAAGCGCACCCCGGGAC (YP_260015.1)
NK22-F ATGTCCAGCAATCCAGAGCTCAAGTACAC Нитрилаза Rhodococcus rhodochrous K22
NK22-R CTGGCCTCCGCCTTGGCCC (D12583.1)
Acidv-1 ATGGTTTCGTATAACAGCAAGTTCCTCG Нитрилаза Acidovorax facilis 72w
Acidv-2 CTACTTTGCTGGGACCGGTTCTTCA (AX384691)
AlcJM3-1 ATGCAGACAAGAAAAATCGTCCGGG Нитрилаза Alcaligenes faecalis JM3
AlcJM3-2 TCAGGACGGTTCTTGCACCAGTAGC (D13419)
Comt-1 ATGAAAAATTATCCTACAGTCAAGGTAGC Нитрилаза Comamonas testosteroni
Comt-2 TCACGCTGTGGCTACGCGCCTC (L32589)
последовательностей проводили с применением программ ClustalW 2.0.9 и YACWGUI 1.2.
Нитрил- и амидгидролизующую активность выделенных клонов определяли при трансформации алифатических и ароматических нитрилов и амидов суспензией клеток, выращенных на синтетической минеральной среде с 0.1 М ацетами-дом в качестве источника углерода и азота. Биомассу центрифугировали 20 мин при 10000 g, отмывали трехкратно 0.01 М калий-фосфатным буфером, рН 7.2 ± 0.2. Реакцию трансформации акрилонитрила и 3-цианопиридина проводили при 30°С в течение 6 ч, реакционную смесь центрифугировали и быстро замораживали при —18°С. Продукты реакции
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.