МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 825-831
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.8+581.557:582.594.2
БАКТЕРИИ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С КОРНЯМИ ЭПИФИТНЫХ ОРХИДЕЙ
© 2004 г. Е. А. Цавкелова*, Т. А. Чердынцева, А. И. Нетрусов
Кафедра микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 30.09.03 г.
Впервые изолированы и идентифицированы бактерии, колонизирующие корни тропических эпи-фитных орхидей Acampepapillosa (Lindl.) Lindl. и Dendrobium moschatum (Buch. - Ham.) Swartz, а также заселяющие внутренние ткани воздушных и субстратных корней A. papillosa. На примере этого эпифита показано, что ассоциативные бактерии встречаются в большем количестве на его воздушных, а не субстратных корнях. Проведено выделение и определение бактерий с субстратных корней D. moschatum и его субстрата (сосновой коры). Исследована природа межклеточного матрикса ассоциативных бактерий.
Ключевые слова: ассоциативные бактерии, тропические орхидеи, межклеточный матрикс.
В настоящее время все больше внимания уделяют изучению микробных взаимодействий с растениями. Ассоциативные микроорганизмы оказывают значительное, и часто благоприятное влияние на развитие растений за счет фиксации атмосферного азота, синтеза фитогормонов, улучшения водного и минерального питания растений, а также образования фунгицидных и бактерицидных веществ, уменьшающих численность фитопатогенов [1]. Считается, что ассоциативные микроорганизмы не образуют каких-либо специализированных структур типа клубеньков на корнях растений, а прикрепляются к корневой поверхности с помощью межклеточного матрикса [2].
Обращать внимание на ассоциативные бактерии орхидных стали сравнительно недавно. Так, в конце 1980-х появились работы австралийских авторов, выделивших эндотрофные бактерии из внутренних тканей субстратных корней наземных орхидей [3, 4]. Они были отнесены к родам Pseudomonas, Bacillus, Xanthomonas, Arthrobacter, Kurthia, некоторое количество бактериальных штаммов принадлежало к энтеро-бактериям. Другой информации, касающейся бактериальной микрофлоры орхидей, в литературе не найдено.
В наших предыдущих работах было установлено, что оранжерейные тропические орхидеи формируют тесные ассоциативные взаимоотношения с фототрофными и гетеротрофными бактериями, а также с микромицетами [5-7]. Необходимость исследований микробных взаимоотношений с орхидеями объясняется отсутствием
* Адресат для корреспонденции (e-mail:tsavkelova@mail.ru).
информации о локализации бактерий, их качественном и количественном составе, а также влиянии микроорганизмов на рост и развитие растения-хозяина. Между тем такая информация существенна при искусственном культивировании редких и исчезающих видов орхидей в ботанических садах.
Целью настоящей работы стало определение родового состава бактериального сообщества, колонизирующего воздушные и субстратные корни оранжерейных эпифитных орхидей, а также исследование природы межклеточного матрикса ассоциативных бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования - воздушные и субстратные корни Acampe papillosa (Lindl.) Lindl. и субстратные корни Dendrobium moschatum (Buch. -Ham.) Swartz. Эти генеративно-зрелые эпифит-ные орхидеи выращивают в условиях Фондовой оранжереи Главного ботанического сада РАН им. Н.В. Цицина (Москва). В природе они встречаются в регионах Юго-Восточной Азии, поселяясь в развалинах и на ветвях высоких листопадных деревьев. Эпифиты образуют воздушные корни, которые, внедряясь в субстрат, функционируют как обычные корни наземных растений. В оранжерее их выращивают как горшечные растения, используя в качестве субстрата сосновую кору. Подробнее условия культивирования описаны ранее [5-7].
Все эксперименты по выделению ассоциативных микроорганизмов проводили в день отбора
проб; возраст корней - от года и старше. Образцы корней и субстрата отбирали с помощью стерильных пинцетов и шпателей и помещали в стерильные стеклянные флаконы. Субстратные корни очищали механически от кусочков сосновой коры, отмывали в стерильной водопроводной воде, стерильно разрезали на мелкие кусочки (1-2 мм) и растирали в стерильной ступке для получения суспензии, из которой готовили ряд разведений. Посевной материал (0.1 мл) наносили на плотную среду Чапека, в которую для предотвращения роста грибов добавляли нистатин в количестве 50 мкг/мл. Инокулят инкубировали в темноте при 30°С до появления отдельных различимых колоний. Чистые бактериальные культуры получали из отдельных колоний путем их пересева на МПА, разведенном в два раза; дальнейшее поддержание культур осуществляли на МПА, МПА, разведенном в два раза, и на среде с крахмалом.
Выделение эндотрофных бактерий (из внутренних тканей корня) проводили по модифицированной методике, описанной ранее [3], для чего очищенные и разрезанные на фрагменты корни А. рарШоза (около 10 мм), стерилизовали в течение 20 мин в 1% растворе гипохлорита натрия. Затем корни трижды по 5-10 мин отмывали в стерильной дистиллированной воде, готовили суспензию, делали разведения и высевали на питательную среду, как описано выше.
Для выделения бактериального комплекса субстрата О. moschatum использовали разведения исходной суспензии, приготовленной из расчета 0.1 г субстрата на 100 мл стерильной водопроводной воды. Сосновую кору предварительно разрезали скальпелем на мелкие кусочки и растирали в ступке. Изучение микробного сообщества орхидей и субстрата проводили в результате посева одноразовых проб в трехкратной повторности.
Для учета бактериальных клеток, заселяющих корневую поверхность орхидей, применяли чашечный метод Коха [8]. Для этого из приготовленных разведений суспензии субстрантных и воздушных корней А. рарШоза микроорганизмы высевали на питательную среду как описано выше. Пересчет проводили на 1 г сухой биомассы корней. Опыт проводили в пяти повторностях.
Определение родовой принадлежности бактерий осуществляли с учетом морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков по общепринятым стандартам [9, 10]. Помимо микроскопирования бактериальных культур для идентификации микроорганизмов были проведены следующие тесты: на наличие оксида-зы, каталазы, способность к денитрификации, использование сахаров, на рост при рН 4.5, окислительно-ферментативный тест на использование глюкозы, тест на наличие фенил-аланин дезами-назы, определение амилолитической и протеоли-
тической активности, а также тест на кислотоус-тойчивость (для микобактерий) и на способность к спорообразованию. Для родового определения актиномицетов были использованы среды Гаузе и овсяный агар (для изучения мицелиеобразова-ния). Более глубокое исследование хемо-таксоно-мических признаков мы не проводили, так как нашей задачей на этом этапе работы не было видовое определение бактерий.
Определение углеводной природы капсул и межклеточного матрикса бактерий проводили качественно с 2,3,5-трифенилтетразолием [11]. Для этого в пробирку помещали 1 мл суспензии культуры микроорганизмов, выращенных в течение 2-3 сут на плотной среде МПА с глюкозой и снятых с нее шпателем. Добавляли 0.5 мл свежеприготовленного 0.3% водного раствора 2,3,5-трифе-нилтетразолия бромистого и 0.5 мл 2 N раствора КаОН. Нагревали на кипящей водяной бане до появления вишневого окрашивания (не более 1 мин) и подкисляли 0.5 мл раствора 2.0 N уксусной кислоты. Суспензию микроскопировали. При наличии термического повреждения клеток - уменьшали время нагревания.
Определение кислой (полианионной) природы капсул и матрикса проводили с цетавлоном [11]. На теплое предметное стекло помещали каплю теплой культуры микроорганизмов средней плотности и добавляли каплю подогретого до 40-50°С реактива (цетилтриметиламмоний бромистый). При наличии в капсуле и матриксе кислых групп моментально формировались хлопья и тяжи комплекса с цетавлоном. Если количество кислых групп в матриксе было незначительно, образование комплекса можно было наблюдать только при мик-роскопировании с увеличением х30 или х100.
Для определения содержания белка и углеводов в капсуле и матриксе бактерий бактериальные культуры выращивали на МПА с 2% глюкозы, смывали стерильным физиологическим раствором с помощью стеклянного шпателя до получения слабовязкого раствора и центрифугировали при 1000 £ 15 мин; надосадочную жидкость диализовали в течение 12 ч [12]. В пробе определяли содержание углеводов фенол-серным методом [13] и белок - по методу Лоури [8].
Для оценки степени полимерности внеклеточных полисахаридов проводили их осаждение разными объемами 96%-ного этилового спирта. К одному объему супернатанта, полученному вышеописанным способом, добавляли два объема 96%-ного этанола при перемешивании (оба компонента должны быть охлажденными до 4-5°С). Смесь оставляли на холоду до формирования осадка полисахаридов. При отсутствии осадка проводили доосаж-дение полимеров еще двумя объемами 96%-ного этанола.
Таблица 1. Бактерии, ассоциированные с корнями тропических эпифитных орхидей
Орхидеи Бактерии Орхидеи Бактерии Эндотрофные бактерии
D. moschatum, Bacillus A. papillosa, Bacillus Bacillus
воздушные корни* Flavobacterim воздушные кори Flavobacterium Flavobacterium
Nocardia Micrococcus Pseudomonas
Pseudomonas Pseudomonas Rhodococcus
Curtobacterium Rhodocuccus Xanthomonas
Rhodococcus Streptomyces
Xanthomonas Xanthomonas
D. moschatum, Acinetobacter A. papillosa, Acinetobacter Alcaligenes
субстратные корни Aquaspirillum субстратные корни Bacillus Bacillus
Bacillus Cellulomonas Gluconobacter
Pseudomonas Gluconobacter Pseudomona
Rhodococcus Mycobacterium Pseudomonas Streptomyces
* Данные по бактериальному сообществу воздушных корней О. moschatum получены ранее [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В предыдущих работах [5, 7], при сравнении фотографий сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) корневой поверхности воздушных и субстратных корней эпифитных орхидей, нами было отмечено, что бактерии активнее колонизируют воздушные корни этих растений, чем их субстратные корни. Результаты количественного учета бактериального комплекс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.