научная статья по теме БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЛИНЕЙНЫХ ОЛИГОМЕРОВ EPSILON-КАПРОЛАКТАМА Химия

Текст научной статьи на тему «БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЛИНЕЙНЫХ ОЛИГОМЕРОВ EPSILON-КАПРОЛАКТАМА»

УДК 579.222.2

БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЛИНЕЙНЫХ ОЛИГОМЕРОВ едо/ои-КАПРОЛАКТАМА

© 2014 г. Т. З. Есикова*, Е. В. Акатова**, С. А. Таран***

*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290 **Тульский государственный университет, Тула, 300012 ***ООО МБЦГенериум, Москва, 127006 e-mail: das3534@rambler.ru Поступила в редакцию 19.02.2014 г.

Из почвенных проб, загрязненных отходами производства epsilon-капролактама, выделены 5 штаммов бактерий, обладающих уникальной способностью утилизировать его низкомолекулярные линейные олигомеры (олигомеры нейлона). Анализ свойств выделенных штаммов BS2, BS3, BS9, BS38 и BS57 и нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК позволил отнести их к родам Ar-throbacter, Brevibacterium, Microbacterium, Gulosibacter и Achromobacter соответственно. Все штаммы утилизировали также 6-аминогексановую и адипиновую кислоты, которые являются интермедиа-тами катаболизма epsilon-капролактама. Это косвенно указывало на то, что деградация олигомеров у них протекает по пути разложения мономера. Штаммы BS9 и BS57 утилизировали только олигомеры epsilon-капролактама, а BS2, BS3 и BS38 деградировали также капролактам и его гомологи — энантолактам и каприллактам, что отличало их от известных узко специфичных деструкторов олигомеров и свидетельствовало о наличии у этих штаммов кроме 6-аминогексаноатдимергидролазы также ферментов, обладающих лактамгидролазной активностью.

DOI: 10.7868/S0555109914050043

Современная практическая деятельность человека сопровождается загрязнением биосферы токсичными неприродными соединениями, которые трудно включаются в естественный обмен веществ и энергии. Метаболический потенциал микроорганизмов позволяет удалять из окружающей среды поллютанты самой различной природы. Исследование механизмов возникновения новых катаболических путей, структурно-функциональных изменений в молекулах отдельных бактериальных ферментов и целых ферментных систем, происходящих в процессе адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям окружающей среды, является одной из фундаментальных проблем биологии. Подобные исследования имеют большое практическое значение для решения задач экологии, биотехнологии и метаболической инженерии.

Капролактам (ер,«7оя-капролактам, лактам 6-аминогексановой кислоты, циклический амид, КАП) — один из наиболее востребованных на мировом рынке химических продуктов, ежегодное мировое производство которого исчисляется миллионами тонн. Более 90% произведенного КАП используется для получения полимерных материалов (поликапроамид, капрон, нейлон-6), находящих широкое применение в различных отраслях народного хозяйства. В процессе полимеризации КАП образующиеся при его гидролизе молекулы

6-аминогексановой кислоты соединяются друг с другом посредством амидной связи. При производстве полимеров образуются отходы, которые содержат КАП и смесь линейных и циклических олигомеров 6-аминогексановой кислоты, традиционно называемых олигомерами капролактама или нейлона [1, 2]. Производственные отходы подвергаются захоронению или сжигаются. При таком способе утилизации отходов КАП и низкомолекулярные фракции олигомеров могут вымываться из почвы и попадать в грунтовые воды [3]. Из-за токсического воздействия на живые организмы данные поллютанты представляют опасность для окружающей среды и здоровья человека [3, 4]. Отсутствие системных исследований микробных деструкторов КАП и его олигомеров сдерживает развитие безопасных и экономически выгодных технологий биологической очистки отходов соответствующих производств и биоремедиации загрязненных территорий.

К настоящему времени известен ряд микроорганизмов-деструкторов КАП, которые принадлежат к различным таксономическим группам [2, 3, 5—7]. Однако существуют лишь единичные сообщения о бактериях, утилизирующих его линейные и/или циклические олигомеры [8, 9]. Особенности биодеградации олигомеров КАП, разнообразие и филогения окисляющих их бактерий остаются мало изученными. Ранее нами из отхо-

дов химических производств были выделены и охарактеризованы бактерии-деструкторы КАП, но они не использовали его линейные олигомеры в качестве единственных источников углерода и энергии, а лишь осуществляли их трансформацию до соответствующих дикарбоновых кислот [10, 11].

Цель работы — выделение бактериальных штаммов-деструкторов низкомолекулярных линейных олигомеров капролактама из почвенных образцов, отобранных с территории его производства, изучение их физиолого-биохимических свойств и таксономического положения, а также особенностей метаболизма мономера и его олигомеров у выделенных бактерий.

МЕТОДИКА

Выделение бактерий-деструкторов и условия культивирования. В работе использовали почвенные образцы, отобранные с территории химического предприятия "ЩекинАзот", производящего КАП (г. Щекино, Тульская область). Накопительные и чистые культуры выделяли с использованием минеральной среды Эванса [12], содержащей в качестве единственного источника углерода линейный димер КАП (0.1% вес/об.). Для получения ага-ризованных сред добавляли 1.5% агара. Контроль однородности культур осуществляли с помощью световой и электронной микроскопии.

Олигомеры КАП (димер и тример), КАП, энантолактам, каприллактам, 6-аминогексано-вую (6-АГК) и адипиновую (АДК) кислоты вносили в минеральную среду Эванса в концентрации 0.1—0.2% (вес/об.). Культивирование бактерий в жидких селективных средах проводили в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды, при 24°C на качалке (180 об./мин).

Микроскопические исследования. Морфологию клеток изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом "OPTON ICM 405" (Германия), ультраструктурную организацию (препараты, приготовленные методом негативного контрастирования и ультратонкие срезы) — в электронном микроскопе "JEM 100B" ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Препараты бактерий для электронной микроскопии готовили, как описано ранее [13].

Изучение физиолого-биохимических свойств штаммов. Для определения условий оптимального роста бактерий использовали жидкую полноценную среду 5/5, описанную в работе [13]. Температурный оптимум определяли при 4—45°C, влияние рН на рост культур оценивали в интервале от 4.0 до 11.0. Изменения рН среды осуществляли добавлением 3 М NaOH или 1 М HCl. Гало-толерантность изолятов определяли, изменяя

содержание NaCl в интервале от 0 до 10%. Интенсивность роста культур оценивали по ОП при длине волны 590 нм на приборе "UV Specord" ("Carl Zeiss", Германия) при толщине кюветы 5 мм. Каждый вариант опыта был выполнен в 3 повтор-ностях, для анализа были использованы средние величины полученных данных.

Вес сухой биомассы рассчитывали по калибровочной кривой.

Для определения спектра утилизируемых субстратов и биохимических особенностей изолятов использовали Api тесты (Api 20E, Api 20 NE и Api 50 CHB/E) ("BioMerieux", Франция), следуя инструкциям производителя.

Активность каталазы и оксидазы определяли, как описано в работе [14].

Методы геносистематики. Выделение и очистку ДНК осуществляли методом Мармура [15]. Мол. % ГЦ-пар в ДНК определяли методом тепловой денатурации, используя ДНК Escherichia coli К12 в качестве стандарта [16].

Амплификацию, секвенирование гена, кодирующего 16S рРНК, и филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили в соответствии с методами, описанными в работе [13].

Нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S pPHK длиной около 800 п.н. помещены в GenBank под номерами JN787119, JN787120, JN787121, JN787122 и JN787123.

Синтез линейных олигосахаридов. Синтез линейных олигомеров 6-аминогексановой кислоты (олигомеров капролактама) осуществляли согласно описанным методикам в работе [17].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение штаммов-деструкторов. Из почвенных образцов, загрязненных отходами производства КАП, методом накопительных культур было выделено 40 бактериальных штаммов, способных использовать линейный димер капролактама (линейный димер 6-аминогексановой кислоты) в качестве единственного источника углерода и энергии. Тестирование изолятов на принадлежность к грамположительным или грамотрицательным бактериям с помощью экспресс-теста с 3%-ным КОН [18] показало, что среди отобранных для дальнейшего исследования деструкторов, обозначенных как BS2, BS3, BS9, BS57 и BS38, только штамм BS57 относился к грамотрицательным бактериям. Штаммы утилизировали также линейный тример капролактама, т.е. увеличение степени полимеризации олигомеров существенно не влияло на рост бактерий (рис. 1). Бактерии-деструкторы росли как в

ОП590 нм 0.8

(а)

ОП590 нм

(б)

7 8 9 10 Время,сут

7 8 9 10 Время,сут

Рис. 1. Динамика роста штаммов-деструкторов в жидкой минеральной среде, содержащей линейный димер (а) и три-мер (б) капролактама:

1 - Б838, 2 - Б89, 3 - Б82, 4 - Б83, 5 - Б857.

жидкой, так и на агаризованной минеральной среде, содержащей олигомеры КАП. Оптимальная концентрация субстратов составляла 0.2% (вес/об.). Следует отметить, что димер и тример КАП оказывали угнетающее действие на рост бактерий при концентрации 0.5%, а увеличение количества субстратов до 1.0% приводило к полному отсутствию роста.

Морфология и ультраструктура клеток. Клетки штамма Б857 имели форму тонких длинных палочек размером 0.5-0.6 х 2.0-2.5 мкм, подвижных за счет перитрихально расположенных жгутиков (рис. 2а). На ультратонких срезах видна многослойная клеточная стенка, характерная для гра-мотрицательных бактерий. Нуклеоид представлен толстыми протяженными тяжами ДНК, занимающими значительный объем центральной части цитоплазмы клеток (рис. 2б). Строение клеточной стенки штаммов Б89, Б82, Б83 и Б838 было типично для грамположительных бактерий. Клетки штамма Б89 - неподвижны, имели форму коротких палочек или овоидов слегка изогнутой формы (0.5-0.6 х 0.9-1.2 мкм). В центральной зоне цитоплазмы клеток были обнаружены электронно-прозрачные включения, имеющие сходство с гранулами поли-Р-оксимасляной кислоты (рис. 2в). Изолят Б82 представлен неподвижными овоид-ными клетками, размеры которых находились в пределах 0.8-0.9 х 1.0-1.5 м

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком