МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 287-288
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.8.083.12(262.5)
БАКТЕРИИ РОДА РЗУСНЯОБЛСТЕЯ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВОДЫ ЧЕРНОГО МОРЯ
© 2004 г. О. М. Онищенко, Е. А. Киприанова
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
Поступила в редакцию 04.03.03 г.
Род Psychrobacter, наряду с родственными ему родами Moraxella и Acinetobacter, объединяет грам-отрицательные оксидазоположительные нефер-ментирующие беспигментные неподвижные кок-кобациллы, принадлежащие к семейству Moraxel-laceae [1]. Отличительной особенностью психро-бактеров является гало- и психротолерантность (а у некоторых видов - и психрофильность), обеспечивающая их повсеместное распространение в морской и наземной среде обитания. Представители этого рода являются преобладающими в орнито-генных почвах Антарктики. Созданный в 1986 г. род Psychrobacter (с типовым видом P. immobilis) [2] впоследствии пополнился антарктическими видами P. urativorans, P. glacincola и P. frigidicola [3, 4], а также выделенным из клинических источников P. phe-nylpyruvicus [3] и глубоководным P. pacifiensis, изолированным из Японской впадины с глубины 6000 м [5]. Еще два недавно описанных галофильных вида P. submarinus и P. marincola были изолированы из морской воды и асцидий Polysyncraton sp. [6].
При исследовании галофильных бактерий Черного моря нами были выделены грамотрицатель-ные неподвижные микроорганизмы, отнесенные на основании изучения их фенотипических свойств к роду Psychrobacter. Целью настоящей работы был их молекулярно-генетический анализ и детальное таксономическое исследование.
Штаммы бактерий были изолированы из проб морской воды, собранных в июне 2000 г. в аквато-
рии Карадагского природного заповедника по описанной ранее методике [7].
У выделенных культур исследовали общепринятыми методами: окраску по Граму, подвижность, рост при различных температурах и в присутствии различных концентраций КаС1, способность к окислению либо ферментации глюкозы (на среде Хью и Ливсона, модифицированной для морских организмов [8]), наличие диметилпарафе-нилендиаминоксидазы, аргининдигидролазы, лизин- и орнитиндекарбоксилазы, амилазную, жела-тиназную и липазную активность, способность к денитрификации и восстановлению нитратов до нитритов, потребность в ионах натрия для роста, способность к усвоению 80 различных соединений в качестве единственного источника углерода.
Микроскопическое изучение бактерий проводили в препаратах, контрастированных 2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, с помощью электронного микроскопа ЕМВ-100 при инструментальном увеличении 12000-15000 .
Чувствительность к антибиотикам (линкоми-цину, олеандомицину, полимиксину, стрептомицину, эритромицину, тетрациклину, цефалоспорину, фурадонину, азтреонаму, рифампицину, левомице-тину, налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину) изучали на агаризованной среде "В" [8], используя стандартные диски с 10-30 мкг антимикробного агента.
Амплификацию гена 16Б рРНК проводили с универсальными праймерами
Ant 1fw: 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' (с 8-й по 27-ю позиции); 16S5rev: (5'-TTACGCGGCTGCTGGCACG-3'(533-514); LO231rev:(5'-GGTTTCCCCATTCGGAAATC-3' (247-227).
Продукты амплификации были разделены горизонтальным электрофорезом в 1%-ном геле агарозы. Определение нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР продуктов осуществляли на автоматическом сиквенаторе ABI 373А ("Perkin-Elmer"). Сравнение полученных данных с имеющимися в Genbank последовательно-
стями проводили с использованием программы BLAST на сайте NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov).
В результате ПЦР-амплификации и последующего секвенирования для четырех черноморских изолятов были установлены последовательности участков гена 16S рРНК с длиной от 448 до 456 нуклеотидов. Все они оказались наиболее
288
ОНИЩЕНКО, КИПРИАНОВА
сходны (97-98%) с последовательностями 168 рРНК антарктического вида Psychrobacter glacin-со1а. Штаммы этого вида были ранее выделены из льдов восточной Антарктики (ледяной шельф Эмери, 69° ю.ш., 78° в.д.) с глубины 350 м [4].
По своим фенотипическим свойствам исследуемые бактерии соответствуют диагнозу рода Ряу-с^оЬа^ег [2]: это аэробные, грамотрицательные беспигментные неподвижные, неспорообразую-щие, каталазо- и оксидазоположительные кокко-бациллы. Подобно всем описанным до настоящего времени представителям рода, они не имели аргининдигидролазы, орнитин- и лизиндекарбок-силазы, не требовали дополнительных факторов роста, хорошо росли на простых минеральных средах и усваивали бутират, аспарагин, глютамат и пролин в качестве единственного источника углерода и энергии Все они росли при температуре от 4 до 15°С и были устойчивы к 6.5% КаС1.
Одной из отличительных черт психробактеров (включенной в диагноз рода) является их чувствительность к пенициллину [2]. Однако сообщения последних лет [6] свидетельствуют о том, что некоторые морские виды этого рода к пенициллину устойчивы. Все черноморские изоляты также были в наших опытах пенициллинрезистентными.
Среди микроорганизмов рода Psychrobacter описаны как галофильные, так и галотолерантные виды. Черноморские культуры требуют для роста ионы и сходны в этом отношении с Р. glacincola, однако если последний выдерживает до 15% №С1 в среде, для исследуемых бактерий максимально переносимой является концентрация 10%.
Набор потребляемых бактериями источников углерода достаточно широк и включает более 20 соединений (О-глюкозу, сахарозу, трегалозу, целлобиозу, фруктозу, декстрин, ацетат, пропио-нат, бутират, лактат, фумарат, малат, сорбит, этанол, ж-оксибензоат, а-аланин, ¿-глютамат, аспарагин, ¿-гистидин, ¿-пролин, саркозин). При значительном сходстве спектров углеродного питания с таковыми Р. glacincola, наблюдаются и некоторые различия. Они касаются способности черноморских психробактеров усваивать названные выше углеводы, недоступные для антарктического вида.
Подобно другим психробактерам, черноморские бактерии - психротрофы. Однако в отличие от Р. glacincola, для которого верхняя граница температуры роста 22°С, нижняя -18°С, а оптимум лежит при 13-15°С, эти бактерии растут при более высоких температурах - от 5 до 28°С.
Антибиограммы изолятов свидетельствуют об их высокой чувствительности к большинству антимикробных агентов, кроме пенициллина и лин-комицина.
Таким образом, из воды Черного моря нами изолированы галофильные представители рода Psychrobacter, отличающиеся от других видов рода
и обнаруживающие определенную фенотипичес-кую и генетическую близость экстремофильному виду Р. glacincola, выделенному из глубинных слоев антарктического льда. Полученные данные -97-98% сходства последовательностей 16Б рРНК -не позволяют сделать окончательный вывод о видовой принадлежности черноморских микроорганизмов. Возможно, штаммы Р. glacincola населяли мировой океан еще несколько десятков миллионов лет тому назад, когда он покрывал всю поверхность нашей планеты. Впоследствии с образованием Черного моря и ледяного покрова Антарктиды эти микроорганизмы эволюционировали под влиянием условий своего существования, с чем связаны их отличия в отношении к температуре, уровням солености и т д. Ответ на вопрос о том, представляют ли собой черноморские изоляты самостоятельный новый вид рода Psychrobacter, должна дать гибридизация ДНК-ДНК.
Работа выполнена при финансовой поддержке ШТАБ (грант № У8Р-01/1-0001).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Rossau R., Van Landschoot A., Gillis M, De Ley. Taxonomy of Moraxellaceae fam. nov., a new bacterial family to accomodate the genera Moraxella, Acinetobacter, and Psychrobacter and related organisms // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P. 310-319.
2. Juni E, Heym G.A. Psychrobacter immobilis gen. nov. sp. nov. genospecies composed of Gram-negative, aerobic, oxidase-positive coccobacilli // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 388-391.
3. Bowman J.P., Cavanagh J., Austin J, Sanderson K. Novel Psychrobacter species from Antarctic ornitogenic soils // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. № 4. P. 841-848.
4. Bowman J. P., Nichols D.S., McMeekin T.A. Psychrobacter glacincola sp. nov., a halotolerant, psychrophilic bacterium isolated from Antarctic sea ice // Syst. Appl. Microbiol. 1997. V. 20. P. 209-215.
5. Maruyama A., Honda D, Yamamoto H, Kitamura K, Higashihara T. Phylogenetic analysis of psychophylic bacteria isolated from the Japan Trench, including a description of the deep-sea species Psychrobacter paci-fiensis sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 835-846.
6. Romanenko L, Schumann P., Rohde M, Lysenko A., Mikhailov V., Stackerbrandt E. Psychrobacter submari-nus sp.nov. and Psychrobacter marincola sp. nov., psychrophilic halophiles from marine environments // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1291-1297.
7. CMipHoe ВВ., Онищенко O.M., KinpiaHoea O.A. MopcbKi грамнегативш еубактери, iзoльoвaнi з води, молюсюв та водоростей Чорного моря // Мжробюл. журн. 2001. Т. 64. № 4. С. 3-8
8. Baumann P, Baumann L. The marine gram-negative Eu-bacteria // The Prokaryotes. A handbook on habitats, isolation and identification of bacteria / Eds. Starr M.P. et al. Berlin: Springer-Verlag, 1986. V. 2. P. 1302-1331.
MHKPOBHOnorHH том 73 < 2 2004
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.