научная статья по теме БАКТЕРИИ ЦИКЛА СЕРЫ В ОСАДКАХ ХВОСТОХРАНИЛИЩА ДОБЫЧИ ЗОЛОТА В КУЗБАССЕ Биология

Текст научной статьи на тему «БАКТЕРИИ ЦИКЛА СЕРЫ В ОСАДКАХ ХВОСТОХРАНИЛИЩА ДОБЫЧИ ЗОЛОТА В КУЗБАССЕ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 4, с. 535-544

= ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 579.8.06:546.22

БАКТЕРИИ ЦИКЛА СЕРЫ В ОСАДКАХ ХВОСТОХРАНИЛИЩА ДОБЫЧИ ЗОЛОТА В КУЗБАССЕ

© 2009 г. О. В. Карначук1, *, А. Л. Герасимчук1, Д. Бэнкс2, Б. Френгстад3, Г. А. Стыкон1, 3. Л. Тихонова1, А. X. Каксонен4, Я. А. Пухакка4, А. С. Яненко5, Н. В. Пименов6, *

1Томский государственный университет 2Университет Ньюкасла, Великобритания 3Норвежская геологическая служба, Трондхейм 4Технологический университет, Тампере, Финляндия 5ГосНИИгенетика, Москва 6Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва

Поступила в редакцию 05.05.2008 г.

Изучено разнообразие и численность культивируемых микроорганизмов, принимающих участие в окислении серы и восстановлении сульфата в окисленных осадках хвостохранилища добычи золота в Кузбассе. Осадки характеризовались низким рН от 2.4 до 2.8, высоким содержанием 8 О^ , до 22 г/л, и высокими

концентрациями растворенных металлов. Содержание мышьяка достигало 1.9 г/л. Филогения бактерий в микрокосмах была изучена путем амплификации фрагментов гена 168 рРНК и последующим разделением их методом гель-электрофореза в денатурирующем градиенте (ОвОЕ). Единственными бактериями, для которых известна способность к диссимиляционному восстановлению сульфата, были спорооб-разующие Desulfosporosinus. Desulfosporosinus 8р. ББ, филогенетически удаленный от известных культивируемых и некультивируемых представителей этого рода, выделен в чистую культуру. Сульфатредуцирующие Deltaproteobacteria не обнаружены. Самыми многочисленными филотипами в микрокосмах были представители Firmicutes, включая обособленный кластер, гомология представителей которого с Pelotomaculum составляла не более 94%. В анаэробных и микроаэрофильных микрокосмах обнаруживали AcidithiobacШus ferrooxidans и АсМйЫоЬасШ^ caldus. Максимальная численность суль-фатредукторов не превышала 9.5 х 102 кл/мл.

Ключевые слова: гель-электрофорез в денатурирующем градиенте, кислые шахтные воды, сульфатредуцирующие бактерии, хвостохранилища добычи и производства золота, AcidithiobacШus, Desulfosporosinus, РеШотатЫт, ПегттсоШа.

Добыча и переработка сульфидных руд металлов сопряжена с образованием больших количеств твердых отходов. При производстве золота объем концентрата после стадий обогащения и флотации может составлять не более 1% от общего количества переработанной руды [1]. Отходы добычи, включая мелкодисперсные фракции, не подвергаются дальнейшей переработке и размещаются в непосредственной близости от места производства. Так называемые "хвосты" объединяют отходы с высокой концентрацией ассоциированных сульфидов, образующиеся после обогащения, и отходы флотации и цианирования. Широкомасштабные процессы окисления остаточных сульфидов в хво-стохранилищах золота и сульфидных руд представляют серьезную угрозу окружающим экосистемам, являясь источником кислых дренажных вод с высо-

* Адресат для корреспонденции (е-шаП: olga.karnachuk@green. tsu.ru, npimenov@mail.ru).

кой концентрацией ионов металлов. Хемолито-трофные бактерии, использующие серу и железо в качестве доноров электронов, вносят существенный вклад в окислительные процессы и выведение металлов в раствор, в то время как микробное восстановление сульфатов может служить возможным механизмом осаждения металлов в этих экосистемах [2].

Целью настоящей работы было изучение разнообразия и численности культивируемых микроорганизмов, принимающих участие в окислении серы и восстановлении сульфата в окисленных осадках хвостохранилища добычи золота на месторождении "Новый Берикуль" в Кузбассе, где, по предварительным данным, нами был зарегистрирован заметный процесс бактериальной сульфатредукции (Карначук и др., неопубликованные данные).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования были осадки бывшего хвостохранилища месторождения "Новый Бери-куль" в Кузбассе, где добыча рудного золота осуществлялась в 1933-1941 и 1949-1951 годах [3]. На берегу реки Мокрый Берикуль производилось размельчение, флотация и цианирование руды. Здесь же размещали отходы производства в хвосто-хранилище, ограниченном дамбой. В конце 90-х годов часть осадков хвостохранилища была вывезена и засыпана пустой породой. Однако оставшаяся часть отходов продолжает окисляться, что приводит к образованию многочисленных высачиваний, характеризующихся низким уровнем рН и высокой концентрацией растворенных металлов.

Пробы верхнего окисленного слоя осадков и придонной воды отбирали 11 июля 2006 г. Температуру, рН и проводимость воды определяли на месте ионо-метром HANNA HI 8314F. Воду для остальных химических анализов фильтровали в полиэтиленовые флаконы объемом 120 мл через фильтр 0.45 мкм. Определение концентрации ионов металлов проводили в лаборатории Норвежской Геологической Службы методами масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS) и атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-AES). Концентрацию анионов определяли там же с помощью ионного хроматографа (Dionex 120 DX). До проведения анализа пробы хранили в холодильнике при 4°С. При определении концентрации металлов пробы подкисляли 0.5% HNO3 (ч.д.а) для исключения возможной адсорбции/осаждения. Подкисленную аликвоту анализировали на Thermo Jarrell Ash ICP 61 (ICP-AES) и Finnigan Mat с Meinhart Nebulizer CD-1 (ICP-MS).

Численность сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) определяли методом предельных разведений на жидкой пресноводной среде Видделя [4] с использованием лактата, ацетата и этанола в качестве доноров электронов. Пенициллиновые флаконы полностью заполняли средой, в качестве дополнительного источника железа использовали стальную скрепку, которая также способствовала поддержанию низкого окислительно-восстановительного потенциала среды за счет выделения катодного водорода и служила сайтом нуклеации при образовании сульфида железа. Культивирование серий предельных разведений проводили при 28°С. Рост СРБ оценивали по потемнению среды в результате образования сульфида железа, а также по приросту сероводорода. Все серии предельных разведений осуществляли в трех повторностях. Наиболее вероятное количество бактерий рассчитывали по таблицам Мак-Креди.

Накопительные культуры СРБ были получены путем пересевов на среду Видделя из серий предельных разведений для определения численности. Лак-

тат, ацетат, этанол и формиат использовали в качестве субстратов роста, культивирование проводили при 28°С. Для выделения чистой культуры были использованы последние в серии разведений флаконы с заметным ростом СРБ из осадков. Используя их в качестве инокулята, проводили регулярные пересевы на ту же среду с одновременным увеличением начальной концентрации Cu(II) в среде до 650 мг/л. Медь вносили в качестве добавки из отдельно стерилизованного стокового раствора CuSO4 ■ 5H2O. Чистоту культуры проверяли микроскопически, а также секвенированием близкой к полной нуклео-тидной последовательности гена 16S рРНК.

Для создания микрокосмов один миллилитр верхнего слоя осадков и придонной воды помещали в пенициллиновые флаконы, которые заполняли до верха средой Видделя с различными органическими добавками (лактатом, ацетатом, этанолом). В различных вариантах начальный рН доводили до 7 или 2, и вносили дополнительно ионы Cu(II) в концентрации 200 мг/л. Микрокосмы также культивировали в микроаэрофильных условиях, оставляя половину флакона незаполненной. В микроаэрофильных условиях для всех микрокосмов использовали лактат, вносили Cu(II) до концентрации 200 мг/л и культивировали при рН 2. Все флаконы были закрыты резиновой пробкой и обжаты сверху алюминиевым колпачком. Культивировали микрокосмы в течение трех месяцев при температуре 28°С.

ДНК из микрокосмов выделяли с использованием кита MO BIO PowerSoil DNA Kit ("MO BIO Laboratories, Inc", Carlsbad, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для определения филогенетической принадлежности культивируемых микроорганизмов методом гель-электрофореза в денатурирующем градиенте (DGGE) первоначально проводили амплификацию фрагмента гена 16S рРНК, соответствующего позициям 341-926 Escherichia coli с использованием прайме-ров GC-BacV3f (5'-GCclamp-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3') и 907r (5'-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3') [5]. Смесь для ПЦР-реакции содержала 1 мкл матрицы ДНК (в концентрации превышающей 50 нг), 5 мкл 10х буфера для DNAzyme DNA Polymerase ("FINNZYMES") (содержит 1.5 мкМ MgCl2), 1 мкл BSA ("Fermentas"), 0.2 мкл 25 мкМ смеси dNTP ("Amersham"), 0.25 мкл каждого прай-мера, 0.4 мкл DNAzyme II DNA Polymerase 2и/мкл ("FINNZYMES"). Амплификацию проводили с использованием Thermocycler T3000 ("Biometra®", Ни-дерданды) по следующей программе: (1) первоначальная денатурация при 95°С в течение 5 мин; (2) последующие 30 циклов денатурация при 94°С в течение 30 с; (3) отжиг праймеров при 50°С в течение

1 мин; (4) элонгация праймеров при 72°С в течение

2 мин; (5) окончательная элонгация при 72°С в течение 10 мин. Присутствие ПЦР-продукта визуализировали в 1% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Разделение амплифицированных

фрагментов ДНК методом DGGE проводили с использованием системы INGENY phor U-2 ("Ingeny International BV", Нидерланды) в линейном градиенте мочевины и формамида между 20 и 70% (для проб XillQ и 30 и 70% (для проб Xiltf) (100% денатурирующие условия определяли как 7 M мочевину и 40% формамид) в 8% акриламидном геле. Электрофорез проводили при 100 В в течение 22 ч при 60oC. После электрофореза гель окрашивали в растворе SYBR Gold в соответствии с инструкцией фирмы-производителя ("Invitrogen") и фотографировали на трансиллюминаторе 3UV фотокамерой Kodak с программным обеспечением Kodak 1D. Полосы вырезали из геля и инкубировали в течение 12 ч в 20 мкл воды MilliQ при 4oQ Cупернатант затем использовали для Пи^-реамплификации с теми же праймерами, но без GC-clamp. При этом был использован тот же режим амплификации, однако в смесь для ПЦ^ не добавляли BSA. Cеквенирование последовательностей ДНК осуществляли коммерчески в Macrogen LTD, ^ул, Корея.

Для определения

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком