УДК577.151.042,35; 578.81; 579.842.11, 14
БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ФАГА SPZ7: ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА
© 2010 г. П.А. Левашов1*, Д.В. Попов2, В.М. Попова2,
Е.Л. Жиленков2, О.А. Морозова3, Н.Г. Белогурова1, С.А. Седов1, И.А. Дятлов2, Н.Л. Клячко1, А.В. Левашов1
1 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-5417, электронная почта: levashov@aport.ru
2 Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, 142279 пос. Оболенск Серпуховского р-на Московской обл.; факс: (0967)772-714, электронная почта:popoviie@mail.ru
3 Межклиническая бактериологическая лаборатория Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, 119021 Москва, ул. Большая Пироговская, 6; факс: (499)248-7398, электронная почта: molgalex@yandex.ru
Поступила в редакцию 28.12.09 После доработки 09.03.10
Исследованы препараты бактериолитических фаговых ферментов экзолизина и эндолизина. Экзолизин (фагассоциированный фермент) получен из хвостовой фракции частиц фага, эндолизин — из бесфаговой цитоплазматической фракции разрушенных клеток Salmonella enteritidis. Разработана методика очистки данных ферментов и измерены их молекулярные массы. Обнаружено, что основные каталитические свойства исследуемых ферментов (оптимальное для активности значение рН и специфичность по бактериальным субстратам) сходны. Оба фермента эффективно лизируют клетки Escherichia coli аналогично куриному яичному лизоциму, но намного эффективнее его при лизисе клеток S. enteritidis и не эффективны при лизисе Micrococcus luteus — хорошего субстрата для лизоцима. Ввиду выявленного сходства характеристик экзолизина и эндолизина не исключено, что данные ферменты близки или даже идентичны по структуре.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фаговый фермент, лизис бактериальной клетки, бактериолитическая активность.
Исследование фаговых бактериолитических ферментов актуально как для понимания механизмов встраивания фага в бактериальные клетки, так для разработки антимикробных препаратов новых поколений, высокоселективных диагностических систем и т.д. [1, 2]. Бактерии семейства Enterobacteriaceae, к которым относится Salmonella enteritidis, представляют особый интерес для изучения, так как многие из них — опасные патогены для человека [3, 4]. Каталитические свойства бактериолитических ферментов бактериофага SPZ7 до настоящего времени не были охарактеризованы.
Основное внимание уделяется разработке удобных методик для постановки экспериментов по изучению ферментативного лизиса на та-
Принятые сокращения: ГРМ — гидролизат рыбной муки, ГАФД — глицеральдегидфосфатдегидрогеназа, КОЕ — число колониеобразующих единиц, БОЕ — число бляшко-образующих единиц, ДТТ — ОЬ-дитиотреитол.
* Адресат для корреспонденции.
ких «живых субстратах», как грамотрицательные микроорганизмы семейства Еп1егоЪае1ег1аееае, с обоснованием корректности турбидиметричес-ких количественных измерений бактериального лизиса.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы: Tris («ICN Biomedicals», США); овальбумин и миоглобин из сердца лошади, фосфорная кислота («MP Biomedicals», США); кумасси G-250 («Ferak», Германия); NaOH, KOH («Ameresco», США); соляная кислота («Germed», Германия); NaCl («Merck», Германия); NAD+, ЭДТА, Na3AsO4, CuSO4, лимонная кислота, CsCl, DL-дитиотреи-тол (ДТТ), полимиксин М, лиофилизирован-ный препарат M. luteus («Sigma Aldrich», США); БСА, куриный яичный лизоцим, DOWEX 50WX8-400, бариевая соль DL-глицеральдегид-3-фосфат диэтилацеталя («Serva», Германия);
1299
8*
Sephadex G-75 superfine, голубой декстран-2000, рибонуклеаза А из поджелудочной железы быка («GE Healthcare», Швеция); стерильные фильтры серии Durapore PVDF («Millipore», США); DEAE-Toyopearl 650М («Toyosoda», Япония); бульон Хоттингера и панкреатический гидроли-зат рыбной муки (ГРМ) (Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ), Россия); штамм Escherichia coli АТСС 25922, штамм S. enteritidis 60 из коллекции Государственного контрольного института медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича и фаг SPZ7 из коллекции ГНЦ ПМБ; дистиллированная вода двойной перегонки.
Для измерения светопоглощения растворов использовался двухлучевой спектрофотометр UV-1601PC («Shimadzu», Япония). Измерения проводились в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Для проведения хроматографическо-го разделения использовалась хроматографи-ческая система Econo («Biorad», США). Детекция разделяемых белков проводилась по свето-поглощению при 280 нм. Для детекции разделяемых белков также измеряли бактериолитичес-кую активность фракций. Центрифугирование препаратов осуществлялось с помощью центрифуг ОПН-8 («Дастан», Киргизия), Minispin («Eppendorf», Германия) и ультрацентрифуги L-5-50 («Beckman», США).
Титр фага в препаратах определяли путем подсчета стерильных пятен (модифицированным методом Грация) [5]. Концентрацию белка в растворах измеряли по связыванию красителя кумасси G-250 [6] или с помощью биуретовой реакции [7, 8].
Определение активности ферментов. Была разработана удобная и быстрая методика определения активности бактериолитических ферментов на живых бактериальных клетках. В качестве основного субстрата мы выбрали хозяина фага — живые клетки S. enteritidis. Было установлено, что изучаемые ферменты проявляют активность и по отношению к живым клеткам E. coli — дополнительному субстрату. Его использовали при очистке изучаемого фермента, так как не было обнаружено никаких фракций, которые были бы активны только по отношению к S. enteritidis и неактивны по отношению к E. coli или наоборот.
Различные образцы живых клеток могут демонстрировать несколько различные картины лизиса, поэтому для максимальной стандартизации препарата важно соблюдать одинаковые условия выращивания. Для определения бакте-риолитической активности ферментов клетки S. enteritidis и E. coli выращивали на ГРМ-агаре при
37° в течение 14 ч. Выращенные клетки суспендировали в 0,9%-ном растворе МаС1, центрифугировали 5 мин при 5000 затем ресуспендиро-вали в 0,9%-ном растворе №С1. Концентрацию клеток в данной суспензии подбирали такой, чтобы при разведении в 50 раз оптическое поглощение при 650 нм составляло 0,5—0,6. Для измерений использовали свежевыращенные клетки или клетки, однократно замороженные жидким азотом, которые хранились при —70° не более 1 мес. В течение эксперимента (до 1 ч) препараты клеток-субстратов хранили при 5°.
Для измерения бактериолитической активности мы выбрали турбидиметрию, а именно измерение снижения светопоглощения (А) суспензии клеток при длине волны 650 нм. Было экспериментально установлено, что для суспензий клеток с оптическим поглощением <1,0 начальное значение А (А0) линейно зависит от количества добавленных клеток. При глубоком лизисе клеток остаточное светопоглощение препаратов стремилось к некоторому постоянному значению (Аш), которое мы условно принимали за светопоглощение «глубоко лизирован-ных разрушенных клеток». То, что по величине 0 = (А0 — А)/(А0 — Аш) можно оценивать полноту лизиса препарата, было подтверждено независимыми экспериментами по подсчету остаточных КОЕ (колониеобразующих единиц) и уровню активности цитоплазматического фермента глицеральгегид-3-фосфатдегидрогеназы (Аафд) в растворе после отделения клеток центрифугированием. Было подтверждено, что для каждого конкретного препарата 0 является однозначной функцией переменных КОЕ и ^ГАФд.
Вполне адекватно использовать в дальнейшем в качестве меры уровня бактериолитичес-кой активности ферментов начальную скорость лизиса, а именно измеряемые величины А0/Ат или АА/Ат. Время т из соображений экспериментального удобства мы выбрали равным 2—3 мин. В отсутствие бактериолитического фермента изменения А в использованной буферной смеси не наблюдалось. С большой долей уверенности можно утверждать, что не было заметного неферментативного лизиса или оседания клеток.
В качестве стандартного раствора для измерения активности использована буферная смесь 0,01 1ш-НС1, рН 8,5. Среда с низкой ионной силой выбрана для облегчения осмотического разрушения клеток после ферментативного нарушения целостности их клеточной стенки. При введении в упомянутую буферную смесь №С1 в концентрациях 0,02, 0,05 и 0,1 М наблюдается уменьшение регистрируемой экспериментально величины АА/Ат в 1,9, 4,2 и 7,7 раза соответственно. Значение рН 8,5 для определения ак-
тивности было выбрано как pH-оптимум активности изучаемых ферментов, который был установлен экспериментально.
Ферментативную активность ГАФД измеряли так же, как описано в работе [9], по увеличению светопоглощения раствора при 340 нм. Она соответствует максимуму в спектре поглощения восстановленной формы кофермента (NADH). Коэффициент поглощения для NADH принимали равным 6220 М-1 ■ см-1 [10]. Измерения активности проводили в буферной смеси 50 мМ глицин/КОН, pH 8,5, содержавшей 2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ДТТ и 3 мМ Na3AsO4. Концентрации NAD+ и глицеральдегид-3-фосфата при измерении активности были 1 и 4 мМ соответственно. Измерения каталитической активности всех ферментов проводили при 37°.
Определение молекулярной массы бактериологических ферментов. Молекулярную массу на-тивных ферментов определяли методом гельпро-никающей хроматографии [11]. Использовалась хроматографическая колонка 0,53 см2 х 27,5 см с Sephadex G-75 superfine, скорость подачи элю-ента 5,8 мл/ч. Элюенты: буферная смесь 0,02 М Tris-HCl, pH 7,5, содержавшая 1 мМ ЭДТА и 0,075 (или 0,15, или 0,3) М NaCl. В качестве маркеров молекулярной массы использовали голубой декстран 2000 (2000 кДа), БСА (67 кДа), овальбумин (43 кДа), миоглобин (18 кДа) и ри-бонуклеазу А (13,7 кДа). Хроматографическое разделение проводили при 20°.
Выделение ферментов. Для выделения эндо-лизина 30 мл 18-ч культуры S. enteritidis (1010 КОЕ/мл) вносили в 3 л бульона Хоттингера и подращивали при 37° с аэрацией 2-3 ч до концентрации 1015 КОЕ/мл. 300 мл очищенного фа-голизата (взвеси фаговых частиц в физиологическом растворе) с концентрацией 1014 БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) добавляли в приготовленную культуру и культивировали с аэрацией 25 мин. Затем и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.