УДК 577.112.083+577.151.6:571.27
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ БАРАНА
© 2012 г. С. А. Седов*, #, Н. Г. Белогурова*, С. В. Шиповсков*, М. В. Семёнова**, М. М. Гитинов***, А. В. Левашов*, П. А. Левашов *, ***,## *Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3
**Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва ***Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Москва Поступила в редакцию 21.07.2011 г. Принята к печати 20.10.2011 г.
В работе проведено исследование бактериолитических факторов плазмы крови здорового барана. Обнаружены и охарактеризованы три фермента, ранее не описанные в литературе. Два фермента, проявляющие активность по отношению к Escherichia coli, имеют молекулярные массы 15 ± 2 кДа. Третий фермент, проявляющий активность по отношению к E. coli и Micrococcus luteus, имеет массу 34 ± 4 кДа. Для всех ферментов определены кинетические параметры бактериального лизиса, в частности, найдены оптимальные значения pH для каждого из использованных субстратов. Для идентификации ферментов был проведен трипсинолиз и масс-спектроскопическое исследование фрагментов. Результаты были сопоставлены с данными о белках барана из баз данных Swiss-Prot, NCBI, MSDB.
Ключевые слова: бактериолитический фермент, плазма крови, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis.
ВВЕДЕНИЕ
Бактериолитическими традиционно называют ферменты различной субстратной специфичности, осуществляющие разрушение клеточной стенки бактерий. Клеточные стенки бактерий имеют сложное химическое строение, следовательно, лизис может осуществляться различными ферментами — гидролазами, в частности, глико-зидазами и протеиназами [1]. Источниками бактериолитических ферментов служат животные, растения, грибы, микроорганизмы и бактериофаги [1—6]. В настоящее время значительное число публикаций посвящено изучению бактериолити-ческих ферментов [1, 4—7], что связано с их широким применением в генной инженерии, медицине и в различных отраслях промышленности. Недавняя вспышка инфекционных заболеваний в Европе показала актуальность разработки альтернативных методов диагностики и лечения заболеваний различной этиологии, в частности заболеваний, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами [8].
Несмотря на то, что бактериолитические ферменты известны давно, до сих пор практически не существует надежных корректных методик для экспериментального изучения каталитических
Авторы для связи: +7 (495) 939-34-29; эл. почта: sergey.sedov@gmail.com.
## +7 (495) 939-34-29; +7 (926) 303-50-14; факс: +7 (495) 93954-17; эл. почта: levashov@yahoo.com.
характеристик данных ферментов на их естественных субстратах — системах живых интакт-ных клеток. Практически отсутствует методическая база для определения оптимальных условий измерения бактериолитической активности, что существенно ограничивает возможности исследования свойств ферментов, способных лизиро-вать бактериальные клетки. В последние годы были предложены новые подходы для описания подобных сложных систем [7, 9—11], что открывает дополнительные перспективы для обнаружения и описания данных ферментов в живых системах, в частности в плазме крови животных. Детальное исследование свойств бактериолитических факторов животных весьма актуально для понимания различных аспектов функционирования иммунной системы и для разработки новых лекарственных средств.
Целью настоящей работы является изучение спектра бактериолитических компонентов (факторов) плазмы крови барана при помощи разработанного ранее количественного подхода к описанию ферментативного бактериального лизиса.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При первичном разделении белков плазмы крови барана при помощи осаждения с (NH4)2SO4 и дальнейшей гель-фильтрации на Sephadex G-75 superfine было обнаружено, что все активные в отношении используемых нами субстратов бакте-
M, кДа
100 80 60 40 20
Номер фракции
Рис. 1. Хроматограмма фракционирования неочищенного препарата на колонке с Sephadex G-75. Контроль: ^280 (1), активность по M. luteus (2), активность
по E. coli (3). Активность (dA65o/dt, с-1) измеряли при добавлении 60 мкл препарата к 1 мл суспензии клеток. Объем фракции 5 мл.
риолитические факторы осаждаются в интервале от 0 до 60% насыщения (NH4)2SO4. В супернатан-те после 60% насыщения (NH4)2SO4 не были обнаружены бактериолитические факторы. Дробно осаждать в интервалах более узких, чем 0-60% (NH4)2SO4, мы сочли нецелесообразным, так как ввиду ограниченности метода осаждения солями была большая вероятность перекрестного осаждения белковых факторов в разных фракциях. В дальнейшем мы планировали более глубокое разделение белков средствами хроматографии.
0.2
т
0 сГ
X
33
CD in чо
1 0.1
На рис. 1 представлена хроматограмма разделения белков на колонке с Sephadex G-75 superfine, полученных после их осаждения (NH4)2SO4 (60% от насыщения) из плазмы крови барана. По отношению к субстратам E. coli и M. luteus активными оказались белки во фракциях, относимых к молекулярным массам 30—38 кДа. Белки во фракциях с М 13—17 кДа оказались активны только в отношении E. coli. Активных белков по отношению к субстрату Bacillus subtilis при этом разделении мы не обнаружили.
Дальнейшее разделение активных фракций с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M показало, что из фракции белков с М 30—38 кДа выделяется единственный фактор, активный в отношении E. coli и M. luteus, элюиру-емый в ионообменной хроматографии при концентрации NaCl 1М. Далее этот фактор с учетом специфичности действия и молекулярной массы обозначили M34EM. Из фракции белков с М 13— 17 кДа выделяются два бактериолитических белковых фактора (рис. 2), активных в отношении только E. coli. Далее эти два фактора, элюируемые при меньшей и большей ионной силе с DEAE-сорбента, обозначили соответственно М15Е-1 и M15E-2. Таким образом, из плазмы крови барана были выделены три фактора белковой природы, проявляющие бактериолитическую активность.
Определенные методами гель-фильтрации и электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 3) молекулярные массы выделенных белков составили 34 ± 4 кДа (фактор M34EM) и 15 ± 2 кДа (факторы М15Е-1 и M15E-2).
1.0
0.5? £
Кон-
мл
Рис. 2. Хроматограмма фракционирования препарата фракций М13-17 кДа на колонке с DEAE-Toyopearl 650M. троль: A280 (1), градиент концентрации NaCl (2), активность по E. coli (3).
М, кДа 200 120
85 70
60
50 40
30
25
20
15
10
Рис. 3. Электрофореграмма очищенных препаратов бактериолитических факторов в 12% ПААГ. Обозначены полосы: M15E-1 (1), M15E-2 (2), M34EM (3).
В таблице приведен протокол очистки бактериолитических белковых факторов из плазмы крови барана. Следует обратить внимание на то, что после разделения белковых факторов ионообменной хроматографией суммарная активность препаратов резко возрастает. Это может свидетельствовать о наличии в плазме крови ингибиторов, прочно связанных с факторами и не отделяющихся при проведении гель-фильтрации. Поиск таких эндогенных ингибиторов может быть предметом дальнейшего исследования. В процессе очистки не обнаружено изменения массы белков в пределах погрешности эксперимента. Это может свидетельствовать в пользу того, что, предположительно, связывающиеся с белком ингибиторы имеют сравнительно небольшую молекулярную массу.
Все выделенные белковые факторы были проверены на гомогенность в условиях электрофоре-тического разделения в присутствии SDS. Небольшая примесь БСА, обнаруженная на электрофоре-граммах очищенных препаратов (рис. 3), связана с его использованием для соосаждения с помощью (МН4)^04 белков-факторов на предпоследней стадии очистки. Данная примесь не влияла на результаты последующего масс-спектрометрическо-
го анализа выделенных бактериолитических факторов, так как в нем использовался препарат каждого фактора, полученный из отдельного участка геля, соответствующего массе фактора.
Следует отметить, что все выделенные факторы при проведении электрофоретического разделения слабо окрашиваются красителями Coo-massie R250 и G250; это же наблюдается при определении концентрации белка методом Брэдфорд (рис. 4). Это может свидетельствовать об особенности аминокислотного состава поверхностных участков белковой глобулы или же их частичном гликозилировании, препятствующем связыванию красителя на значительной части поверхности белка. Однако вопрос о наличии олигосаха-ридных фрагментов в составе белков требует дальнейшего более тщательного исследования, выходящего за рамки данной работы.
УФ-спектры М15Е-1 и М15Е-2 сходны, а спектр M34EM несколько отличается (рис. 5). Это может быть косвенным свидетельством в пользу схожести аминокислотного состава М15Е-1 и М15Е-2.
Была изучена бактериолитическая активность очищенных препаратов белковых факторов на клетках E. coli, M. luteus и B. subtilis в сравнении с
Очистка бактериолитических факторов из плазмы крови барана. Выход рассчитан по активности
Стадия Белок, мг/мл Белок, мг Активность, у.е./мг Активность, у.е. Выход стадии, % Выход общий, %
Исходно 70.2 1050 - - - -
Осаждение (МН4)2Я04 15.1 670 - - - -
Гель-фильтрация I
М34ЕМ 0.58 38 0.084 3.2
М15Е-1 0.36 16.2 0.11 1.78 - -
М15Е-2 0.36 6.8 0.11 0.75
Гель-фильтрация II
М34ЕМ 0.37 30 0.10 3 94 94
М15Е-1 0.21 12.6 0.12 1.51 85 85
М15Е-2 0.21 5.4 0.12 0.65 87 87
Ионообменная хроматография I
М34ЕМ 0.18 2.7 5.3 14.3 477 447
М15Е-1 0.090 0.90 7.1 6.4 410 374
М15Е-2 0.070 0.70 4.4 3.1 413 571
Ионообменная хроматография II
М34ЕМ 0.13 2.0 5.6 11.2 78 350
М15Е-1 0.075 0.75 7.6 5.7 89 320
М15Е-2 0.050 0.50 5.4 2.7 87 360
Гель-фильтрация III
М34ЕМ 0.35 1.8 5.7 10.3 92 320
М15Е-1 0.23 0.46 12.0 5.5 96 310
М15Е-2 0.21 0.42 5.9 2.5 92 140
лизоцимом из белка куриных яиц при различных значениях pH. В отличие от яичного куриного ли-зоцима, ни один из факторов не проявляет активности на клетках B. subtilis (рис. 6). Возможно, это обусловлено низкой патогенн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.