БИОХИМИЯ, 2G12, том 77, вып. 11, с. 1567 - 157G
УДК577.151.01; 571.27; 579.61
БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА
© 2012 г. П.А. Левашов*, С.А. Седов, Н.Г. Белогурова, С.В. Шиповсков, А.В. Левашов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, 119991 Москва; факс: (495)939-5417, электронная почта: levashov@yahoo.com
Поступила в редакцию 16.05.12 После доработки 02.06.12
В работе впервые обнаружено наличие бактериолитической активности у интерлейкина-2, регулирующего иммунный ответ белка-цитокина. Сравнение бактериолитических свойств интерлейкина-2 с куриным яичным лизоцимом показало большую специфичность первого к грамотрицательным бактериям Escherichia coli. В отличие от яичного лизоцима интерлейкин-2 не вызывает лизиса грамположительных кокков Micrococcus luteus и грамположительных спорообразующих палочек Bacillus subtilis. Полученные сведения расширяют понимание биологических функций интерлейкина-2, который влияет на течение различных онкологических и инфекционных заболеваний.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: интерлейкин-2, бактериолитическая активность, Escherichia coli.
Бактериолитические факторы широко распространены в природе и вызывают огромный практический и теоретический интерес в различных областях химии, биологии и медицины. В последние годы предложены новые практические и теоретические подходы [1—4], расширяющие возможности скрининга и более глубокого исследования характеристик бактериоли-тических факторов, содержащихся в различных биологических объектах. Нами [5] были получены данные о структурном сходстве одного из бактериолитических факторов плазмы крови млекопитающего (барана) с интерлейкином-2. Однако оставалось неясным, является ли данный фактор сам интерлейкином-2 или его изо-формой, может ли интерлейкин-2 сам по себе быть активной формой бактериолитического фактора. В данной работе исследована бактериолитическая способность коммерческого препарата человеческого интерлейкина-2, используемого в медицине для инъекций пациентам с онкологическими заболеваниями и сепсисом [6, 7]. Для сравнения был использован известный бактериолитический фермент яичный куриный лизоцим.
* Адресат для корреспонденции.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы: ронколейкин (раствор очищенного интерлейкина-2 для внутривенного и подкожного введения) («Биотех», Россия); Tris («ICN Biomedicals», США); кумасси G-250 («Ferak», Германия); CuSO4, NaOH, Na2CO3, лимонная кислота («Merck», Германия); соляная кислота («Germed», Германия); куриный яичный лизоцим, лиофилизованный препарат Micrococcus luteus («Sigma Aldrich», США); сефа-декс G-25 superfine («GE Healthcare», Швеция); WorkBeads™ 40SEC («Bio-Works», Швеция); клетки Escherichia coli (музейный штамм JM109), предоставленные Дж. Мессингом (Waksman Institute, New Jersey, США); Bacillus subtilis, штамм 168trpC2, из музея ВНИИ генетики. Перед экспериментом препарат интерлейкина-2 очищали от консервирующих низкомолекулярных добавок пропусканием 1 мл исходного препарата через колонку (диаметр 1 см и высота 5 см) с сефадексом G-25, уравновешенным буферной смесью, использованной для измерения активности. Препарат ронколейкина электро-форетически гомогенен (данные производителя [8]). Чистота ронколейкина дополнительно была проверена с помощью ВЭЖХ, которую про-
1567
1568
ЛЕВАШОВ и др.
водили со скоростью 0,3 мл/мин на колонке WorkBeads™ 40SEC (0,8 х 30 см), уравновешенной с буферной смесью 30 мМ Tris-HCl, pH 7,4, с добавкой 0,15 М NaCl. Детектирование при ВЭЖХ было по поглощению при 280 нм. Профиль элюции представлял собой один пик. Удельная активность очищенного препарата не отличалась от таковой для обессоленного белка, что свидетельствует в пользу отсутствия белковых примесей. Бактериальные клетки перед началом работы промывали с помощью осаждения в течение 5 мин при 5000 g на центрифуге Eppendorf MiniSpin с последующим ресуспенди-рованием в буферной смеси. Концентрацию белка в растворах измеряли спектрофотометри-чески с помощью микробиуретового комплекса [9, 10] с модифицированным реактивом Бенедикта [11]. Для измерения светопоглощения растворов использовался двухлучевой спектрофотометр UV-1601PC («Shimadzu», Япония). Измерения проводились в кюветах с длиной оптического пути 1 см.
Определение бактериолитической активности. Бактериолитическую активность белков определяли турбидиметрическим методом при длине волны 650 нм и температуре 37° [1, 2] с использованием в качестве субстрата клеток E. coli, M. luteus или B. subtilis. В качестве активности приведены значения начального изменения поглощения —dA/dt (с-1), которые в данных условиях связаны постоянным множителем с —dKOE/dt [1], где КОЕ — число колониеобразующих единиц в единице объема. Изменения A во времени наблюдали в течение 300 с. В качестве начальной скорости использовали изменение A в интервале времени c 5 до 20 с от начала лизиса. В отсутствие бактериолитических факторов фонового самопроизвольного лизиса клеток в условиях эксперимента не наблюдалось. При определении активности использовалась суспензия клеток с начальным поглощением A = 0,4. Измерения активности проводили в буферной смеси 20 мМ Tris-HCl с различными значениями pH. Если не указано иное, то значение pH при определении активности было 8,8.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для сравнения интелейкина-2 и яичного куриного лизоцима необходимо было определить их бактериолитическую специфичность по отношению к разным типам бактерий. В качестве различных по свойствам микроорганизмов использовали грамотрицательные палочки E. coli, грамположительные кокки M. luteus и грамполо-жительные спорообразующие палочки B. subtilis
(рис. 1). Для удобства сравнения были взяты разные конечные концентрации лизоцима и ин-терлейкина-2, а именно такие, чтобы скорости лизиса клеток E. coli в присутствии данных двух белковых факторов были соизмеримыми. Как видим, интерлейкин-2 активен только по отношению к E. coli в отличие от куриного яичного лизоцима, который лизирует также M. luteus и B. subtilis. Факт подобной строгой специфичности интерлейкина-2 по отношению к грамотрица-тельному представителю семейства Enterobacte-riciae особенно интересен, так как в литературе имеются данные, что в плазме крови больных с повышенной температурой может содержаться некий белковый бактериолитический фактор, специфичный к грамотрицательным бактериям [12]. Этим фактором теоретически может оказаться сам интерлейкин-2, уровень которого в плазме повышается при ряде заболеваний.
На рис. 2 представлена зависимость скорости бактериального лизиса (—dA/dt) клеток E. coli от концентрации факторов ([E]). Как видно, для достижения соизмеримых уровней скорости лизиса требуется более высокая концентрация ин-терлейкина-2 по сравнению с концентрацией яичного куриного лизоцима, что может быть вызвано разными причинами. Во-первых, ин-терлейкин-2 может иметь иную активность по сравнению с таковой у яичного куриного лизоцима. Во-вторых, не все молекулы интерлейки-на-2 могут быть в активном состоянии. В плазме крови у интерлейкина могут быть неизвестные регуляторы активности, способные «включать» или «выключать» его, не позволяя работать на одном уровне подобно нерегулируемому лизо-
Рис. 1. Субстратная специфичность бактериолитических факторов. Концентрации яичного куриного лизоцима (черные столбцы) и интерлейкина-2 (в крапинку) — 0,25 и 3,0 мкг/мл соответственно
БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА
1569
[Лизоцим], мкг/мл 0 1 2
[Интерлейкин-2], мкг/мл
Рис. 2. Зависимость скорости лизиса E. coli от концентрации бактериолитических факторов. 1 — Лизоцим, 2 — ин-терлейкин-2
рН
Рис. 3. Зависимости скорости лизиса E. coli от pH. Концентрации лизоцима и интерлейкина-2 — 0,25 и 3,0 мкг/мл соответственно. 1 — Лизоцим, 2 — интерлейкин-2
циму. Эти вопросы выходят за рамки данной работы и являются задачей дальнейших исследований. В целом для интерлейкина-2 кинетическая кривая имеет такой же вид, как и для яичного куриного лизоцима. Выход на постоянный уровень при высоких значениях [E], вероятно, связан с тем, что в этих условиях происходит одновременное множественное повреждение клеточной стенки большого числа клеток и ско-ростьлимитирующей стадией процесса разрушения клетки становится осмотический разрыв мембраны [1].
Одна из важнейших характеристик лизиса бактерий в присутствии бактериолитических факторов — pH-оптимум активности [1]. На рис. 3 приведена зависимость скорости лизиса клеток E. coli от pH, которая для интерлейкина-2 несколько отличается от зависимости для лизоци-ма. Колоколообразный вид рН-зависимости для интерлейкина-2 свидетельствует в пользу предположения, что данный фактор также может действовать по механизму бактериолитического фермента. Несмотря на относительно близкие значения pH-оптимумов ферментативного ли-
зиса клеток, формы кривых сильно различаются, что может свидетельствовать о различных аминокислотных остатках, вовлеченных в работу активных центров интерлейкина-2 и лизоцима.
Таким образом, показано, что один из важнейших цитокинов иммунной системы, интер-лейкин-2, обладает свойствами бактериолити-ческого фактора с более строгой специфичностью по сравнению с таковой у яичного куриного лизоцима. Обнаружение специфической бактериолитической активности у интерлейки-на-2 расширяет понимание спектра биологических функций этого белка, используемого как диагностический маркер и как лекарственное средство в онкологии и при сепсисе. Информация о полифункциональности данного цитоки-на имеет практическую ценность для более глубокого понимания характера течения различных тяжелых заболеваний, связанных с сочетанием нескольких патологических процессов. Часто аутоиммунным и онкологическим заболеваниям предшествуют хронические воспалительные процессы, которые нередко имеют инфекционное происхождение [13].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Levashov, P.A., Sedov, S.A., Shipovskov, S., Belogurova, N.G., and Levashov, A.V. (2010) Anal. Chem., 82, 2161-2163.
2. Mitchell, G.J., Nelson, D.C., and Weitz, J.S. (2010) Phys. Biol., 7, 1-12.
3. Sedov, S.A.,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.