научная статья по теме БАКУЛОВИРУСНЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ Биология

Текст научной статьи на тему «БАКУЛОВИРУСНЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 1, с. 142-159

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ВИРУСОЛОГИИ

УДК 577.21;575.113.082.261:579.23

БАКУЛОВИРУСНЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ

© 2011 г. С. Н. Белжеларская

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 Поступила в редакцию и принята к печати 15.07.2010 г.

Векторы на основе бакуловирусов широко используются для получения гетерологичных белков в культурах клеток насекомых и млекопитающих. Современные бакуловирусные системы позволяют экспрес-сировать в одной инфицированной клетке насекомого одновременно несколько генов и получать муль-тимерные белки, функционально близкие природному аналогу. Рекомбинантные вирусы, содержащие промоторы, активные в клетках млекопитающих, используются для доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих in vitro и in vivo. Дальнейшее совершенствование системы на основе бакулови-русов для использования в клетках-мишенях разного типа может открыть дополнительные возможности применения этой экспрессионной системы. В обзоре рассматривается применение модифицированных бакуловирусов для экспрессии рекомбинантных белков в клетках эукариот, преимущества и недостатки системы экспрессии на их основе и обсуждаются возможности их совершенствования.

Ключевые слова: эукариотические системы экспрессии, бакуловирусы, клетки насекомых, клетки млекопитающих, рекомбинантные белки, вирусоподобные частицы, посттрансляционные модификации.

BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMS FOR RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION IN INSECT AND MAMMALIAN CELLS, by S. N. Beljelarskaya (Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: belj@eimb.ru). The baculovirus vector systems has been extensively used for the expression of foreign gene products in insect and mammalian cells. New advances en-crease the possibilities and applications of the baculovirus expression system, which has the capability to express multiple genes simultaneously within a single infected insect cells and to use recombinant virus with mammalian cell-active expression cassettes to permit expression of recombinant proteins in mammalian cells in vitro and in vivo. Future investigations of the baculovirus expression system designed for specific target cells, can open wide variety of applications. This review summarizes the recent achievements in applications the baculovirus vector systems and optimization recombinant protein expression in both insect and mammalian cell lines.

Keywords: expression systems of eukaryote, baculoviruses, insect cells, mammalian cells, recombinant proteins, virus-like particles, post-translation modifications.

ВВЕДЕНИЕ

Векторы для переноса чужеродных ДНК в клетки млекопитающих и эукариотические системы экспрессии, основанные на их использовании и обеспечивающие эффективную продукцию биологически активных белков in vitro и in vivo, постоянно совершенствуются. Известны разные методы введения чужеродных генов в клетки эукариот — при помощи физико-химических способов доставки (электропорации, бомбардировки микрочастицами золота или вольфрама и т.д.) или при помощи различных вариантов биологической доставки (липид-ных коньюгатов — липосом, рекомбинантных вирусов и т.д). В течение последних двух десятилетий предложено большое число вариантов векторов на

* Эл. почта: belj@eimb.ru

основе различных вирусов как средства доставки чужеродных генов в клетки-мишени. С помощью вирусов — естественных переносчиков чужеродной ДНК в клетки млекопитающих — генетический материал проникает в клетки-мишени, при этом уровень трансфекции клеток in vitro и in vivo, а также экспрессии внесенных генов высок.

Экспрессирующие векторы на основе бакулови-русов позволяют синтезировать полноценные эука-риотические белки в культивируемых клетках насекомых с таким выходом, уровень которого пока не достигнут ни в одной другой эукариотической системе гетерологичной экспрессии генов. Способность бакуловируса насекомых передавать генетическую информацию клеткам млекопитающих позволяет использовать векторы на его основе в

качестве экспрессирующих векторов для клеток млекопитающих. Так как бакуловирус, передавая информацию клеткам млекопитающих, сам не реплицируется, то векторы на его основе удобны и безопасны in vitro и in vivo. Высокая емкость бакулови-русных векторов и биологическая безопасность определяют интерес к этой системе и к ее совершенствованию. Экспрессионная система на основе бакуловирусов, позволяющая эффективно продуцировать полноценные эукариотические белки в широком спектре клеток млекопитающих in vitro, ex vivo и in vivo, может рассматриваться как перспективная альтернатива векторам на основе вирусов человека. В настоящем обзоре рассмотрены особенности бакуловирусов и систем экспрессии на их основе.

ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ПЕРЕНОСА И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ

Векторы на основе вирусов млекопитающих, которые обеспечивают эффективное проникновение генов в клетки-мишени, удобны в качестве естественных векторов для переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот. При выборе оптимальной системы важны такие критерии, как простота методологии применения, сила промоторов и возможность их регуляции во времени, скорость получения значительных количеств активных эукариотических белков и т.д. В зависимости от специфики решаемой проблемы предпочтение отдается тому или иному вектору.

К сожалению, все известные in vitro и in vivo векторные системы доставки репортерных генов далеки от совершенства, хотя проблемы доставки экзогенных ДНК in vitro, в основном, решены. Системы же переноса чужеродных генов в клетки-мишени млекопитающих in vivo продолжают совершенствоваться. Например, такие характеристики векторных систем, как стабильность их в интегрированном состоянии, регулируемая экспрессия, безопасность использования, все еще нуждаются в доработке. В идеале важно достичь не только устойчивости введенного гена, но и эффективной экспрессии в течение длительного времени.

При решении задач, связанных с совершенствованием систем эффективного переноса и экспрессии трансгенов в клетках эукариот in vitro и in vivo, в основном, используют различные векторы на основе вирусов человека. Применяются векторы на основе ретровирусов, аденовирусов, аденоассоцииро-ванных вирусов, вируса герпеса, лентивирусов, ба-куловирусов. Каждая система на их основе имеет свои преимущества и недостатки.

Однако наиболее удобной представляется экспрессионная система на основе бакуловирусных векторов, ее преимущества очевидны. Можно указать на то, что размеры внедренных трансгенов могут достигать 100 т.п.н., а уровень их экспрессии и синтеза рекомбинантных белков высок. Вектор может одновременно экспрессировать несколько генов, включая несплайсированные. Вирус не реплицируется в клетках млекопитающих, и это облегчает его использование в качестве вектора для доставки репортерных генов в клетки млекопитающих как in vitro, так и in vivo. С его помощью можно осуществлять прямое адресное клонирование при временной и стабильной трансдукции клеток млекопитающих. Можно трансдуцировать первичные клетки разного типа — при широком спектре клеточной специфичности. Бакуловирус может инфицировать неделящиеся клетки, нецитотоксичен, не инфекционен для человека. Это тем более удобно потому, что врожденный иммунитет к большинству вирусов человека ограничивает применение векторов на их основе. И бакуловирусы предлагают путь к преодолению этой проблемы, а именно — создание рекомбинантных вирусов не человеческого происхождения в качестве векторов для переноса генов. Врожденной гуморальной и клеточной иммунной памяти у человека по отношению к бакуло-вирусам нет, поскольку они инфекционны только для насекомых.

К недостаткам этой системы можно отнести то, что посттрансляционные модификации белков в клетках насекомых в отдельных случаях неадекватны модификациям в клетках человека, и то, что чувствительность бакуловируса к действию системы комплемента при доставке чужеродных генов в клетки и ткани млекопитающих in vivo достаточно велика. Тем не менее, на сегодняшний день бакуло-вирусная векторная система успешно применяется для доставки генетической информации в клетки эукариот in vitro и ее использование для доставки генов in vivo продолжает расширяться. Векторы на основе бакуловирусов находят все большее применение в фундаментальной и прикладной биологии, в биомедицине, для разработок, направленных на создание методов диагностики, вакцинации и геноте-рапии.

БАКУЛОВИРУСЫ Биология бакуловирусов

Что собой представляют бакуловирусы (сем. Ba-culoviridae)? Сведения о них обнаружены еще в материалах XVI века, в которых сообщалось о "вялой болезни" гусениц шелкопряда, вызванной, как сейчас очевидно, бакуловирусом. Бакуловирусы патоген-

Рис. 1. Схема жизненного цикла бакуловируса. Заражая растения, вирус вместе с пищей попадает в кишечник гусениц, затем путем эндоцитоза попадает в клетки кишечника, где вирусная ДНК, избавляясь от капсида, проникает в клеточное ядро, в котором происходят репликация и транскрипция ДНК вируса и формирование нуклеокапсида. От плазматической мембраны инфицированных клеток отпочковываются частицы внеклеточной промежуточной формы вируса — отдельные вирионы. На заключительной фазе инфекции отдельные вирионы упаковываются в белковые тельца включения-полиэдры, в которых вирионы эффективно сохраняются в окружающей среде.

Лизис инфицированных клеток после

гибели гусеницы

/

Репликация, транскрипция вирусного генома; упаковка в полиэдры

Белковые тельца включения (полиэдры)

Растворение полиэдринового 4 Отпочковывающиеся матрикса в кишечнике

частицы вируса

т*

ры

Вирусная ДНК ^^

Вторичная инфекция

Отдельные вирионы

отпочкованного созревшего вируса

Цитоплазма

„ Первичная инфекция

Слияние ^ ^

Зрелый вирус, заключенный в полиэдрах

ны для членистоногих, особенно для насекомых, инфицируя более 30 их видов. Из бакуловирусов наиболее хорошо изучены вирусы ядерного поли-эдроза (nucleopoly

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»