МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2010, том 44, № 3, с. 541-550
ДРУГИЕ ПРОБЛЕМЫ
УДК 577.21; 578.821
БАКУЛОВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ДОСТАВКИ И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2010 г. Н. Н. Королева, П. В. Спирин, А. В. Тимохова, П. М. Рубцов, С. Н. Кочетков,
В. С. Прасолов, С. Н. Белжеларская*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991
Поступила в редакцию 06.10.2009 г.
Принята к печати 19.11.2009 г.
Конструирование векторов для переноса экзогенных ДНК в клетки млекопитающих является актуальным направлением современной биотехнологии. При использовании вирусов в качестве естественных векторов в клетках млекопитающих удается достичь эффективной доставки и высокого уровня экспрессии чужеродной ДНК в клетках человека in vitro и in vivo. В представленной работе для направленной доставки и экспрессии клонированных генов в культивируемых клетках млекопитающих Hek293, COS-7 и Huh7 использован модифицированный бакуловирус AcMNPV, получивший название BacMam вирус, содержащий экспрессионную кассету с промотором цитомегаловируса и репортерным геном зеленого или цианового флуоресцентного белка. Полученные нами модифицированные бакуловирусы в форме трансфер-векторов pFastBacMamGFP эффективно доставляют гены структурных белков вируса гепатита С (ВГС) в клетки млекопитающих Нек293Т и Huh7, где происходит экспрессия целевых белков, их процессинг и сборка вирусоподобных частиц ВГС. Эффективность доставки экспрессирующих конструкций в клетках-мишенях подтверждена методами флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии и иммуноблотинга.
Ключевые слова: бакуловирус АсМГСРУ, ВасМат вирус, клетки насекомых 819, клетки Нек293, С08-7 и НиЬ7, вирус гепатита С, структурные белки ВГС.
BACULOVIRUS VECTORS FOR EFFICIENT GENE DELIVERY AND EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS, by N. N. Koroleva, P. V Spirin, A. V. Timokhova, V. S. Prasolov, P. M. Rubtzov, S. N. Kochetkov, S. N. Beljelarskaya* (Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia 119991; *e-mail: belj@eimb.ru). Baculovirus expression vectors are extensively used for the delivering foreign genes and expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Modified baculoviruses containing mammalian promoter elements (BacMam viruses) for an efficient transient and stable transduction of diverse mammalian cells prove a high level of heterologous proteins' expression both in vitro and in vivo. Recombinant baculovirus vectors containing mammalian expression cassette with cytomegalovirus promoter, green or red fluorescent protein gene, polyadenylate signal SV40pA, and polylinker MCS were constructed for the delivery of genes encoding hepatitis C virus structural proteins into mammalian cells. In Hek293T and Huh7 cells formation of glycoprotein complexes and HCV-like particles was observed. A high efficiency of the baculovirus-mediated gene transfer and expression of the virus envelope proteins in mammalian cells was demonstrated with using fluorescence, flow cytometry and immuno-blot techniques.
Key words: baculovirus AcMNPV, BacMam virus, hepatitis C virus (HCV), HCV structural proteins, HCV-like particles, mammalian cells Hek293, COS-7 and Huh7, Sf9 insect cells.
Бакуловирусная система экспрессии рекомби-нантных белков в клетках насекомых стала широко развиваться и использоваться в начале 1980-х годов, после появления первых сообщений о применении рекомбинантных бакуловирусов для экспрессии чужеродных белков в клетках насекомых 8ройор1ега
Принятые сокращения: CMV — цитомегаловирус; MCS — полилинкер (multiple cloning site); SV40pA — поли(А)-последова-тельность вируса SV40; ВГС — вирус гепатита С.
* Эл. почта: belj@eimb.ru
frugiperda [1—4]. Интерес к этой системе еще более возрос после того, как было показано, что рекомби-нантные бакуловирусы можно применять для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетки млекопитающих [4, 5]. Эрнст и др. [6] показали возможность использования технологии с участием ба-куловируса для создания и скрининга экспрессион-ных библиотек эукариотических генов. Способность бакуловируса ЛеМРУ эффективно доставлять гены в культивируемые клетки млекопитающих, в том числе в гепатоциты, в 1995 г. впервые описана
Хофманом и др. [7], подтверждена Бачером и Бой-сом в 1996 г. [8] и до сих пор привлекает внимание исследователей. Так как бакуловирус, передавая генетическую информацию клеткам млекопитающих, не инициирует цикл репликации и продукции инфекционного вируса, рекомбинантные бакулови-русные векторы стали использовать в исследованиях, связанных с разработкой эффективных систем для переноса и экспрессии чужеродных генов функциональных белков in vitro и in vivo. [9, 10]. С этой целью при конструировании бакуловирусных векторов в них вводят регуляторные элементы, функционирующие в клетках млекопитающих.
Транскрипция репортерного гена в клеточных линиях млекопитающих с участием рекомбинант-ных бакуловирусов контролируется различными промоторами, активными в клетках млекопитающих [7—9]. На сегодняшний день показано, что ба-куловирус эффективно трансдуцирует различные типы клеток [10—13], включая и первичные культуры клеток человека; причем самый высокий уровень экспрессии рекомбинантных генов наблюдается в клетках печеночного происхождения [7]. Недавно показано, что бакуловирусные векторы способны инфицировать неделящиеся клетки, обеспечивая транспорт бакуловирусного нуклеокапсида через поры клеточного ядра, стволовые клетки [14—16]. Список клеточных линий млекопитающих, чувствительных к бакуловирусной трансдукции, постоянно расширяется. Использование бакуловирусов в качестве экспрессирующих векторов позволяет синтезировать эукариотические белки в культивируемых клетках насекомых и млекопитающих с таким выходом, уровень которого не достигнут ни в одной другой эукариотической системе гетерологичной экспрессии генов. Более того, высокая емкость ба-куловирусных векторов и биологическая безопасность рекомбинантных бакуловирусов определяют растущий интерес к этой системе и ее постоянное совершенствование. Рекомбинантные бакуловиру-сы, содержащие промоторы, активные в клетках млекопитающих, могут быть ценными векторами для доставки генов в клетки (ткани, органы) млекопитающих как in vitro, так и in vivo.
Фипальдини и др. [17] изучали репликацию вируса гепатита C (ВГС) с помощью бакуловирусной трансдукции клеток Huh7, помещая полноразмерную кДНК вируса под контроль промотора цитоме-галовируса (CMV). Трансдукция клеток Huh7 гибридным бакуловирусом, несущим последовательность кДНК ВГС, приводила к экспрессии полипротеина ВГС и его правильному процессингу с образованием структурных и неструктурных белковых продуктов генома вируса. Однако, стабильных клеточных линий, экспрессирующих структур-
ные белки с образованием вирионов ВГС, получено не было. Исследование структурных особенностей вириона ВГС и его морфогенеза осложнено тем, что ВГС не удается размножать ни in vitro (из-за низкой репликативной активности в клеточных культурах), ни in vivo (из-за ограниченного спектра хозяев). Низкая эффективность репликации вируса в культуре клеток, отсутствие адекватных клеточных культур и животных моделей приводят к поиску новых альтернативных систем для изучения ВГС. Вирусоподобные частицы ВГС, полученные в клетках млекопитающих, могут служить удобной моделью для изучения проникновения вируса в клетку и вирусного морфогенеза в целом. На сегодняшний день известно, что два поверхностных гликопротеина ВГС определяют его инфекционный потенциал [18—20], однако их роль в инфекционном цикле вируса пока изучена мало.
В этой работе мы использовали рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие структурные белки ВГС в зараженных клетках насекомых Sf9, для трансдукции клеток Hek293T и Huh7. Показано, что созданные конструкты эффективно доставляют экс-прессирующие гены в клетки млекопитающих. Разработанная система позволит в дальнейшем изучать функциональные особенности структурных белков ВГС, их взаимодействие друг с другом, процессинг оболочечных белков, а впоследствии создать адекватную систему продуцирования ВГС в клетках млекопитающих.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные клетки и клеточные культуры. В
работе использованы бактериальные штаммы Escherichia coli DH5a и DH10Bac (Gibco-BRL, США), а также линия клеток насекомых Spodoptera frugiperda Sf9 и клеточные линии эмбриона почки человека HEK293, почки зеленой мартышки COS-7 и гепато-целлюлярной карциномы человека Huh7.
Трансформацию бактериальных клеток плазмид-ными ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя (Amersham, США) и руководству [21].
Клетки насекомых культивировали в среде Sf-900 II с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 27°С, используя основные технические приемы, описанные в инструкции "Bac-to-Bac system" (Invitrogen, США) [22]. Титр вируса, амплификацию рекомбинантного вируса, заражение клеток Sf9 рекомбинантным бакуловирусом, а также анализ вирусной экспрессии проводили так, как описано в вышеприведенной инструкции.
Клеточные линии Hek293T, Huh7 и COS-7 культивировали в стандартной среде DMEM, со-
держащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 мM L-глутамин, 1 мM пиру-ват натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл соответственно, при температуре 370С в атмосфере 5% СО2.
Бакуловирусные трансфер-векторы (BacMam) и рекомбинантные бакуловирусные конструкции. Для направленной доставки и экспрессии эукариотиче-ских генов в клеточных линиях человека и животных сконструированы бакуловирусные векторные плазмиды pFastBacMam1GFP, pFastBacMam2GFP и pFastBacMam3GFP с экспрессирующими кассетами под контролем промотора CMV, содержащие репор-терный ген GFP, сигнал полиаденилирования (SV40pA) и полилинкер (MCS). При конструировании в качестве исходной плазмиды использован ба-куловирусный вектор pFastBacHTa.
Рекомбинантные бакуловирусные конструкции pFastBacMam-œFP pFastBacMam-E1E2GFP и pFastBacMam-CE1E2GFP получали, используя сконст
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.