4. Raghuvanshia S., Sharmaa P., Singhb S., Van Kaerc L., Dasa G. PNAS 2010, 107, 50, 21653-21658.
5. Das B., Kashino S. S., Pupu I., Kalita D., Swami V., Yeger H., Felsher D. W., Neto A. C. Science Transla-tional Medicine 2013, 5, 170ra13.
6. Valencic E., Loganes C., Cesana S., Piscianz E., Gai-pa G., Biagi E., Tommasini A. Stem Cell Research and Therapy 2014, 5:3.
7. Wang L., Zhao Y., Shi S. Journal of Dental Research 2012, 91, issue 1, 1003-1010.
8. Pevsner-Fischer M., Cohen-Sfady M., Zanin-Zhorov A., Cohen Sh., Cohen I. R., Zipori D. Blood 2007, 109,1422-1432.
9. Romieu-Mourez R., François M, Boivin M.- N., Bouchentouf M., Spaner D. E. Galipeau J. Journal of Immunology 2009, 182, 7963-7973.
INFLUENCE OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ON THE IMMUNOPHENOTYPE OF MESENCHYMAL BONE MARROW
STROMAL CELLS
Belogorodtsev S. N.1, Schwartz J. Sh.2, Rudina M. I.2, Shakhmuradova A. I.2 Filimonov P. N.3
'Scientific Research Institute of Clinical immunology, Siberian Branch, Academy of Medical Sciences of Russia; 2Scientific Research Institute of Therapy and Prophylactic Medicine, Siberian Branch, Academy of Medical Sciences of Russia; 3Research Institute of Tuberculosis, Ministry of Health of Russia, Novosibirsk
The spectrum of pro-and anti-inflammatory cytokines secreted by mesenchymal stromal cells in the presence of vaccine strain of Mycobacterium tuberculosis (BCG) was investigated. It was shown that when co-cultured with BCG, MSCs significantly increase the production IL-1ß, IL-6, TNFa, IFNy and decrease production IL-10 and TGFß. Furthermore, the supernatant of MSCs that were cultured with BCG increases the proliferation of splenocytes and reduces their apoptosis. These data show that in the presence of mycobacterial infection it is switch of immunophenotype of MSCs from antiinflammatory to proinflammatory and open up prospects for their further research in tuberculosis infection.
Key words: Mesenchymal stromal cells, mycobacterium tuberculosis, cytokines, inflammation, apoptosis, proliferation
БЕЛКИ ОСТРОЙ ФАЗЫ И АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕМЕНТА: МОЖНО ЛИ ГОВОРИТЬ ОБ ОПРЕДЕЛЁННОСТИ ЭФФЕКТОВ В ОРГАНИЗМЕ НА ОСНОВАНИИ ИССЛЕДОВАНИЙ IN VITRO?
Бельтюков П. П.1, Гарнюк В. В.1, Шмурак В. И.1, Бельтюкова М. Е.2
ФГУП «НИИгигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ст. Капитолово, 2ФГБУ «(Федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова», Санкт-Петербург, Россия
Проведена сравнительная оценка результатов исследования концентрации С-реактивного белка (CRP) турбидиметрическим и иммунолюминесцентным методом. Показано, что при нормальных уровнях CRP в сыворотке крови иммунолюминесцентный анализ не даёт лож-ноположительных результатов, при этом количественный результат анализа может существенно отличаться от результатов турбидиметрического определения. Исследованы корреляционные взаимосвязи между параметрами функциональной активности комплемента, концентрациями белков острой фазы и уровнями антител в крови. Показано, что при использовании 12,5 или 25% сыворотки крови в общем объёме инкубационной смеси отсутствует корреляция между уровнем антител к эритроцитам кролика, общими концентрациями IgG и IgM и показателями активности комплемента. Установлено, что между концентрациями отдельных белков острой фазы в сыворотке крови существует умеренная корреляция, отражающая наличие общих механизмов регуляции их биосинтеза.
Ключевые слова: белки острой фазы, система комплемента, активность комплемента
Тематический выпуск «Российский научный форум на Урале»
267
Индукция биосинтеза белков острой фазы находится под контролем провоспалитель-ных цитокинов (IL-1ß, IL-6 и TNFa). В свою очередь, синтез этих цитокинов регулируется опосредованно с участием анафилатокси-на С5а, который образуется в ходе активации комплемента [1]. С другой стороны, ряд белков острой фазы, в частности С-реактивный белок (CRP), способствуют увеличению функциональной активности комплемента. Таким образом, можно говорить, что между системой комплемента и белками острой фазы существуют тесные взаимосвязи, обусловленные как непосредственными взаимодействиями белков, так и опосредованные действием цитокинов. Можно ли на основе корреляционного анализа оценить значимость и направленность эффектов отдельных белков острой фазы на функциональную активность системы комплемента в сыворотке крови? При наличии адекватного математического описания взаимодействия белков острой фазы и белков системы комплемента, можно было бы расширить возможности интерпретации результатов анализа функциональной гемолитической активности комплемента.
Кажется очевидным, что между показателями активности комплемента и продукцией белков острой фазы не должно быть строгих концентрационно-функциональных взаимосвязей. В частности, потому что гены, кодирующие отдельные белки острой фазы, располагаются в разных хромосомах, за исключением C-реактивного белка (CRP), сывороточного амилоидного белка (SAP), и L-селектина, которые кодируются генами, расположенными в первой хромосоме, а также альфа-2 макроглобулина (A2M) и фактора фон Виллебранда (vWF), гены которых находятся в хромосоме 12. Помимо этого, индукция одних и тех же генов в разных типах клеток (гепатоциты, макрофаги), опосредованная действием конкретного цитокина не может иметь одинаковый по интегральному количественному результату эффект. Вместе с тем, при соблюдении определённых условий анализа, как было показано ранее, удаётся выявить количественные закономерности, подтверждающие наличие связи между концентрациями отдельных белков системы комплемента, белков острой фазы и показателями функциональной активности комплемента. Так, например, нами были показаны корреляционные связи между параметрами ак-
тивности комплемента и уровнем CRP в ограниченном диапазоне концентраций [2].
Следует отметить, что функциональная активность комплемента, безусловно, зависит от уровня отдельных белков острой фазы, но полной определённости в понимании эффектов на сегодняшний день нет. Более того, если использовать разные тест-системы (например, меняя свойства клеток-мишеней в гемолитической системе или уменьшая долю сыворотки крови в инкубационной смеси) можно убедиться в том, что эффекты белков, способных взаимодействовать с отдельными факторами системы комплемента, не всегда однозначны.
В настоящей работе представлены результаты анализа корреляционныых взаимосвязей между параметрами функциональной активности комплемента и уровнями концентраций белков острой фазы, таких как A2M, CRP, фетуин А, кислый альфа-гликопротеин (AGP), фибриноген, L-селектин, SAP, гаптоглобин, фактор тромбоцитов PF4/CXCL4, адипсин (фактор D системы комплемента), vWF, а также C3 и С4 компоненты комплемента.
Исследование выполнено с использованием 20 образцов сывороток крови, полученных от пациентов кардиологического профиля с нормальным и повышенным содержанием CRP. Уровень CRP определяли двумя методами - турбидиметрическим (Roche Diagnostics, Франция) и иммунолюминесцентным с использованием технологии xMAP (Millipore, США). Помимо CRP ещё 10 белков острой фазы, перечисленные выше, были определены с использованием иммунолюминесцентного анализа. Уровень С3 и С4 определяли с использованием турбидиметрического анализа (Randox, Великобритания). Содержание IgG и IgM определяли иммуноферментным методом. Уровень антител в отношении эритроцитов кролика в исследованных сыворотках оценён методом прямой гемагглютинации. Параметры функциональной гемолитической активности комплемента оценивали на основании кинетической регистрации гемолиза эритроцитов кролика в планшетном фотометре с использованием инкубационной смеси, содержащей неразведённую или разведённую в 2 раза 0,15 М NaCl в количестве 25% от общего объёма смеси, 50% объёма составлял мединаловый буфер (0,05 М, pH 7,4) содержащий Ca2+ и Mg2+ (конечная концентрация Ca2+ в смеси составила - 1,91 мМ, Mg2+ - 6,37 мМ)
или ЭГТА-Mg буфер (0,05 М, pH 7,4; конечная концентрация Mg2+ - 6,37 мМ) для регистрации активации по альтернативному пути (АПК), 25% объёма составляла стандартная суспензия отмытых 0,15 М раствором NaCl эритроцитов кролика. Начальная экстинкция образцов при суммарном объёме смеси 160 мкл в стандартном 96-луночном планшете соответствовала значениям экстинкции 0,45-0,55. Регистрировали изменение экстинкции при 620 нм каждые 20 секунд. По данным кинетики гемолиза рассчитаны параметры Tlag - время до начала эффективного лизиса эритроцитов, Tmax -время достижения максимального значения скорости лизиса, Vlys - максимальная величина скорости лизиса, выраженная в условных единицах (dE620/c).
Обработку данных, вычисление коэффициентов корреляции осуществляли с помощью программ MS Excel 2013 и Prism GraphPad 5.0.
Результаты и обсуждение. Концентрация CRP по данным турбидиметрического определения находилась в исследованных образцах пределах от 0,7 до 65,0 мг/л. Диапазон концентраций, рассчитанный по результатам регистрации CRP иммунолюминесцентным методом составил от 0,7 до 52,0 мг/л. При этом расхождение между результатами турбидиметриче-ского и иммунолюминесцентного определения CRP в единичных образцах достигало 55-65% как в сторону завышения, так и в сторону занижения результата. Следует отметить, что в образцах с нормальным уровнем CRP (до 6 мг/л) ложноположительных результатов при имму-нолюминесцентном анализе не было. Таким образом, основываясь на материалах исследования, можно сказать, что определение CRP иммунолюминесцентным методом на основе технологии xMAP позволяет получить верный результат в случае его попадания в диапазон нормы, однако не обеспечивает совпадения с результатом турбидиметрического анализа.
Оценка параметров функциональной активности комплемента описанным выше методом привела к выводу о том, что использование в ходе анализа высокой доли сыворотки (12,5-25% от общего объёма) не даёт возможности на основании вычисления корреляционных коэффициентов между параметрами гемолиза и содержанием CRP продемонстрировать его активирующий
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.