ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 3, с. 283-289
= БИОХИМИЯ
УДК 577.322.75
БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ФИБРИНСТАБИЛИЗИРУЮЩЕГО
ФАКТОРА (ФАКТОР XIII)
© 2007 г. Е. Ä. Костанова*, М. Ä. Розенфельд*, Т. Ä. Ревина**, Т. Ä. Валуева**
*Институт биохимической физики им. И М. Эмануэля РАИ, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 **Институт биохимии им. А.И. Баха РАИ, 119071 Москва, Ленинский просп., 33, стр. 2
E-mail: ibcp@sky.chph.ras.ru Поступила в редакцию 22.12.2005 г.
Исследовали способность белковых ингибиторов цистеиновых протеиназ (ИЦП), выделенных из клубней картофеля (Solanum tuberosum), подавлять транспептидазную активность фибринстабили-зирующего фактора (ФХШа) прямым блокирующим действием на существенную SH-группу активного центра фермента. Формирование рыхлого сгустка, растворимого в 5 М мочевине и 2%-ной уксусной кислоте, турбидиметрические данные изучения стабилизации и толерантности к плазмину фибриновых сгустков, образованных в присутствии ФХШа и ИЦП из клубней картофеля, а также данные электрофореза восстановленных образцов фибрина, свидетельствуют об уменьшении степени сшитости ковалентными связями фибриновых молекул или полном их отсутствии. Кроме того, установлено, что при введении ИЦП в субстрат, замедляется процесс полимеризации фибриногена практически в 2 раза относительно контроля. Делается вывод о том, что ИЦП природного происхождения способны как участвовать в регуляции транспептидазной активности ФХШа in vitro, так и модифицировать субстрат.
Фактор ХШ (ФХШ, фибринстабилизирующий фактор, фибринолигаза) является наиболее изученной на сегодняшний день трансглутаминазой и ее физиологическая роль установлена (Ichinose et al, 1990). ФХШ представляет собой плазменный белок, который циркулирует в крови в виде тетрамера a2b2 с молекулярной массой 320 кДа, причем две a субъединицы являются каталитически активными, а две b субъединицы - не активными. Молекулярная масса субъединиц одинакова - около 80 кДа. Установлено, что b субъединицы в молекуле фактора XIII стабилизируют a субъединицы (Schwartz et al, 1973; Chung et al., 1974).
В отличие от многих трансглутаминаз, ФХШ является проферментом, который превращается в активную форму протеолитической атакой тромбина в присутствии фибрина (Lewis et al., 1985). Активный фермент (a2, ФХШа) накапливается на последней стадии каскада реакций системы свертывания крови путем освобождения активационного пептида (молекулярная масса 4000) от N^-конца каждой а субъединицы (Schwartz et al, 1973; Takagi, Doolittle, 1974). В присутствии ионов Са2+ тетрамер (a2 b2) диссоциирует на активный димер (a2) и две b субъединицы (Chung et al, 1973; Cooke, Holbrook, 1974; Lorand et al, 1974). Ионы кальция присоединяются к a' субъединицам и демаскируют таким образом ак-
тивные участки в молекуле фермента (Curtis et al., 1974; Cooke, 1974).
ФХШа имеет цистеин в активном центре, однако, в отличие от тиоловых протеиназ, таких как папаин, катепсины В и Н, которые расщепляют пептидные связи, он, как транспептидирующий фермент, образует внутримолекулярные у-глута-мил-е-лизин поперечные связи между молекулами фибрина, тем самым стабилизируя фибрино-вый сгусток механически, а также придает устойчивость к протеолизу (Takahashi et al., 1986).
Образование нерастворимого фибрина находится в прямой зависимости от активности ФХШа. Так, снижение активности фермента ведет к образованию неполноценного сгустка, который легко растворяется в 5 М мочевине или 2%-ной уксусной кислоте, что может стать причиной кровоточивости (Nussbaum, Morse, 1964). Такой процесс лежит в основе кровотечения при врожденном или приобретенном дефиците ФХШ. При увеличении активности, ФХШа вовлекается в патологические процессы, такие как атеросклероз, рост опухоли и метастаз, синдром дыхательного недомогания у младенцев и другие тромботиче-ские заболевания (Muzbek, Laki, 1984; Mc Donagh, 1982).
Как только на последней стадии каскада реакций системы свертывания крови ФХШа генерируется, различные активаторы и ингибиторы могут оказывать действие на его регуляторную роль.
До сих пор мало известно о природе таких соединений в биологических средах, но эксперименты in vitro могут пролить свет на некоторые их возможности.
Согласно современным представлениям, контроль над трансглутаминазной активностью ФХШ можно вести как на ферментном, так и на "субстратном" уровнях, причем, такая регуляция может иметь разные формы (Lorand, Conrad, 1984). Основные структурные требования к ингибиторам поперечного сшивания фибриногена изложены в работе Нилсона с соавт. (Nilsson et al., 1972). Обозначен ряд ингибиторов, которые обладают высокой избирательной специфичностью к поперечносшивающему ферменту (Lorand et al., 1968; Lorand, Conrad, 1984). Основополагающая идея при подборе ингибиторов ФХШ заключается в том, что любой специфический ингибитор должен прикрепиться к остатку цистеина активного центра фермента до реакции поперечного сшивания. Однако все известные соединения, используемые для ингибирования поперечного сшивания ФХШ, обладающие прямым блокирующим действием на активный участок фермента, не являются природными.
Природные белки-ингибиторы протеаз широко распространены в растительном и животном мире. Они составляют особую группу белков, объединяемых общей способностью образовывать с различными ферментами белок-белковые комплексы, что приводит к конкурентному инги-бированию каталитической активности. Белки-ингибиторы обнаружены во многих продуктах питания, в частности, в семенах бобовых, злаковых и масличных растений, фруктах, овощах, картофеле, молоке и различных тканях животных. Свойства и функции большинства из них хорошо изучены (Мосолов, Валуева, 1993; Валуева, Мосолов, 2002). Длительное время ингибиторы протеаз рассматривались как антидиетические факторы в продуктах питания, но в последние годы они стали представлять большой интерес из-за их возможного противоракового (Kennedy et al., 1998) и положительного диетического действий (Hill et al., 1990). В частности, было показано, что антипаин способен подавлять индуцированную канцерогенными соединениями, злокачественную трансформацию in vitro (Borek et al., 1979; Di Paolo et al., 1980; Kuroki, Drevon, 1979), а ингибиторы протеаз из картофеля действуют как противораковые агенты, вмешиваясь в процесс разрастания (т.е. пролиферации) опухолевых клеток (Blanco-Aparico et al., 1998), образования Н2О2 (Frenkel et al., 1987), процессы, происходящие после солнечной УФ-радиа-ции (Huang et al., 1997).
В клубнях картофеля (Solanum tuberosum) ингибиторы протеаз составляют 30% от общего содержания белка (Melville, Ryan, 1972). Помимо
ингибиторов сериновых и аспартатных протеаз, а также ингибитора карбоксипептидаз, клубни картофеля содержат значительное количество ингибиторов цистеиновых протеиназ. Они инги-бируют папаин, лизосомальные катепсины B, H и L и взаимодействуют с этими ферментами в экви-молярных соотношениях (Brzin et al., 1988; Pou-vreau et al., 2001).
Так как ФХШ - тиоловый фермент, подобный во многих аспектах папаину, целью данной работы было исследовать in vitro способность белковых ингибиторов цистеиновых протеаз из клубней картофеля участвовать в регуляции тран-спептидазной активности фермента.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Фибриноген был выделен из цитратной бычьей плазмы, очищен от примесей плазминогена и фибринстабилизирующего фактора, как было описано ранее (Розенфельд и др., 1999).
Фибринстабилизирующий фактор был получен из бычьей крови по методу Лоранда с соавт. (Lorand et al., 1981). Его активность, определенная по методу Лови и Данатана (Loewy, Dunathan, 1961), составила 320 стандартных ед/мл (1 стандартная единица соответствует активности ФХ1Ш, содержащегося в 1 мл донорской сыворотки крови). Перевод ФХШ в активную форму (ФХ1Ш) осуществляли добавлением к проферменту тромбина (Roche, Франция) с активностью 15 NIH/мл (National Institute of Helth, USA) до конечной его концентрации в реакционной смеси 7.5 NIH/мл; смесь инкубировали 10 мин при 25°С.
Плазминоген был выделен из плазмы крови человека методом аффинной хроматографии на лизин-сефарозе 4В (Pharmacia, Швеция) (Deutsch, Mertz, 1970).
Плазмин получали активацией плазминогена стрептазой (Behrigwerke, Германия), как описано ранее (Розенфельд и др., 1984). Активность препарата определяли казеинолитическим методом (Robbins, Sammaria, 1970); она составляла 12 казе-инолитических единиц (к. ед.) на мг белка.
Исходным материалом для выделения ингибиторов служили клубни картофеля сорта Истринский урожая 2003 г. Первоначально клубни картофеля были обработаны ранее описанным способом (Brzin et al., 1988), в дальнейшем осветленную центрифугированием белковую фракцию наносили на аффинный сорбент. В качестве аффинного сорбента, для выделения ИЦП, была впервые использована КМ-химопапаин сефароза 4В, которая была синтезирована по стандартному методу (Bur-rett, 1981). Множественные формы химопапаина были выделены из водорастворимой фракции латекса незрелых плодов дынного дерева Carica papaya по методу, описанному Костановой с соавт.
(1986, 1988). Протеолитическую активность иммобилизованного химопапаина определяли в термостатированной ячейке при 37°С и непрерывном перемешивании. В качестве субстрата использовали казеин с добавками L-цистеина и ЭДТА (этиленди-аминтетрауксусная кислота). Определение про-теолитической активности иммобилизованного химопапаина показало, что содержание активного фермента составляло 0.6-0.8 мг на мл сефарозы. Для определения активности выделенных ингибиторов смеси, содержащие постоянное количество химопапаина, папаина (Merck, Германия) или фи-цина (Calbiochem, США) и различное количество ингибитора (общий объем 1 мл), инкубировали 10 мин при 37°С в 0.5 М mpuc-HCI буфере, pH 8.0 в присутствии L-цистеина и ЭДТА в конечной концентрации 0.005 и 0.002 М соответственно, затем вносили 1 мл субстрата. Остаточную протеолитическую активность тиоловых ферментов, используемых в качестве контроля, определяли с помощью модифицированного метода Кунитца (Arnon, Shapira, 1967). Электрофорез в 20%-ном полиакри-ламидном геле в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.