ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2012, том 54, № 7, с. 1116-1129
УДК 541(13+64):543.865
БЕЛКОВЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ С КОНТРОЛИРУЕМОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ, ПОЛУЧЕННЫЕ ПОСЛОЙНОЙ АДСОРБЦИЕЙ
БИОПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ1 © 2012 г. Н. Г. Балабушевич, В. А. Изумрудов,
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, 119991 Москва, Ленинские горы
В обзоре обобщены и проанализированы данные экспериментальных исследований по получению и свойствам белковых микрочастиц с контролируемой стабильностью, которые формируют методом послойной адсорбции разноименно заряженных макромолекул. Рассмотрены варианты использования белков в качестве адсорбируемых полиэлектролитов, способы включения белков в матрицы (агрегаты и микросферы) для последующего нанесения биополиэлектролитов, а также иммобилизации белков в заранее приготовленные мультислойные полиэлектролитные частицы за счет изменения проницаемости их оболочек. Особое внимание уделено биосовместимым и биоде-градируемым микрочастицам, обладающим функциями депо, т.е. способностью надежно защищать биологически активные вещества от агрессивных сред организма и количественно выделять белковые препараты (гормоны, ферменты, пептиды) в раствор при достижении определенной кислотности среды, что особенно важно для разработки пероральных средств доставки белков.
Н. И. Ларионова
Белки и пептиды широко используются в современной медицине [1, 2]. Они могут играть роль действующего начала (фермента, гормона) или содержаться в лекарственных средствах в качестве биодеградируемых, биосовместимых и биологически активных соединений, способствующих целевой доставке препаратов. Развитие биотехнологии существенно расширяет круг терапевтического использования рекомбинантных белков и пептидов [3], что делает особенно актуальным микро- и нанокапсулирование веществ белковой природы как одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений современной биохимии и фармацевтической технологии.
В настоящем обзоре обобщены результаты работ по микрокапсулированию белков (гормонов, ферментов) и пептидов методом послойной адсорбции разноименно заряженных биополимеров, проанализированы пути контролируемого высвобождения действующего начала из микрокапсул, а также обсуждены перспективы биомедицинского применения подобных препаратов.
Техника послойной адсорбции полиэлектролитов
Метод получения мультислоев послойной адсорбцией разноименно заряженных полиэлек-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 10-03-00019-а) и фонда Министерства образования и науки РФ (договор 11.G34.31.0004).
E-mail: nbalab2008@gmail.com (Балабушевич Надежда Георгиевна).
тролитов (метод LbL в англоязычной литературе или техника ПАП в русскоязычном варианте), который первоначально был предложен в 1966 г. [4] и возродился в начале 90-х годов XX века [5], является унифицированным подходом для получения чередующихся монослоев заряженных макромолекул на поверхности. В основе процесса формования лежит электростатическое взаимодействие заряженной подложки с противоположно заряженными цепями, которое достигается погружением подложки в разбавленный раствор полиэлектролита. В результате электростатического взаимодействия заряды подложки (например, отрицательные) нейтрализуются с образованием монослоя полимера (поликатиона). Важно, что в результате действия стерического фактора добавление эквивалентного (по зарядам) количества цепей практически никогда не приводит к полной нейтрализации зарядов, зафиксированных на подложке на разном расстоянии друг от друга. Некоторые заряды подложки остаются не скомпенсированными, и для их нейтрализации необходимо вводить дополнительное число цепей. Таким образом, первая стадия адсорбции приводит к перезарядке (изначально отрицательной) поверхности и появлению на ней петель и хвостов, несущих избыточное количество (положительных) зарядов. Перезарядка является движущей силой процесса, поскольку именно она обеспечивает вторую и последующие стадии формования, когда подложку с адсорбированным полимером (поликатионом) после промывания и удаления избыточного полимера погружают в раствор противоположно заряженного полиэлек-
тролита (полианиона). Чередующаяся многократная адсорбция обеспечивает образование стабильных полиэлектролитных мультислоев с различными свойствами, которые во многом определяются природой используемых разноименно заряженных синтетических и природных полимерных компонентов [6]. Техникой ПАП удается сравнительно просто, дешево и без специального оборудования получать ультратонкие полиэлектролитные пленки толщиной от 1 до 100 нм [7].
Разработка способов создания полиэлектролитных оболочек на коллоидных частицах различного состава и строения [8, 9] положила начало новой эре капсулирования биологически активных веществ (БАВ) [10]. В публикациях, посвященных применению и развитию техники ПАП для создания новых биомедицинских препаратов [10—15], особое место занимают работы по капсулированию БАВ с использованием заряженных биополимеров. Несмотря на несомненные успехи в этой области исследований [16—19], некоторые ключевые моменты микро- и нано-капсулирования белков и полипептидов остаются малоизученными, что препятствует широкому внедрению подобных конструкций в качестве эффективных лекарственных средств.
Авторы предлагаемого обзора принимали и принимают активное участие в разработке способов иммобилизации белков и ферментов методом ПАП, начиная от модельных систем на основе синтетических полиэлектролитов и заканчивая нано- и микрочастицами, полностью состоящими из биополимеров. Конечной целью исследований является получение нетоксичных, биосовместимых и биодеградируемых нанокапсулиро-ванных препаратов гормонов, ферментов и пептидов с контролируемой стабильностью, способных надежно защищать БАВ от агрессивных сред организма и количественно выделять действующее начало при достижении заданных условий, главным образом при изменении кислотности среды.
Получение белковых микрочастиц послойной адсорбцией полиэлектролитов
В обзорных статьях последних лет [13—15] подробно проанализированы работы по использованию техники ПАП для включения различных БАВ в микро- и наночастицы. Применительно к белкам и полипептидам подход отличается тремя особенностями, которые вместе или порознь определяют успех приготовления частиц с контролируемой стабильностью. Во-первых, белки могут выполнять функцию поликатионов или полианионов, непосредственно участвующих в построении мультислоев. Во-вторых, белки используют для формирования первоначальных агрега-
тов, играющих роль подложки в технике ПАП, на которых затем осуществляют послойную адсорбцию биополиэлектролитов. Наконец, возможно включение белков в заранее приготовленные полиэлектролитные микрочастицы или микрокапсулы путем изменения проницаемости стенок частиц.
Рассмотрим типичные примеры микрокапсу-лирования белков с применением перечисленных особенностей.
Возможность включения белков и полипептидов в оболочку полиэлектролитных микрочастиц определяется их амфотерной природой. Белки являются полиамфолитами благодаря наличию в их составе карбоксильных групп кислых аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой) и азотсодержащих групп основных аминокислот (ю-ами-ногруппа лизина, амидиновый остаток аргинина и в несколько меньшей степени имидазольный остаток гистидина). При значениях рН выше и ниже изоэлектрической точки молекулы белка заряжены соответственно отрицательно и положительно, т.е. варьируя кислотность среды можно наделять белок функциями полианиона или поликатиона. Способность белков играть роль полиэлектролитов многократно подтверждалась при изучении их адсорбции на различных поверхностях. В 1995 г. были получены и исследованы мультислои разных водорастворимых белков (ци-тохром, лизоцим, гемоглобин, гистоны) и ферментов (глюкоамилаза, каталаза, глюкозооксида-за) в парах с синтетическими полиэлектролитами, главным образом полистиролсульфонатом (ПСС), полиаллиламином (ПАА) и разветвленным полиэтиленимином (ПЭИ) [20]. На ядра из полистирольного латекса послойно адсорбировали глюкозооксидазу и каталазу, фиксируя изменение поверхностного заряда частиц [21]. Мульти-слои, состоящие из белка и синтетического полиэлектролита, успешно формировали на ядрах коллоидных микрочастиц органического и неорганического происхождения [10]. В качестве материала ядер использовали меламиноформальде-гидную смолу [8], сополимер лактида и гликолида [22], кристаллы органических и неорганических веществ [23, 24], карбонаты металлов [25—27], кремнезем [28, 29], золото [30], клетки [31, 32], микроагрегаты ДНК [33, 34]. После сборки полиэлектролитной оболочки коллоидные ядра в некоторых случаях разрушали. Так, ядра из карбоната кальция растворяли соляной кислотой или этилендиаминтетрауксусной кислотой, ядра из меламиноформальдегидной смолы — соляной кислотой [8], а кремнеземные ядра обрабатывали плавиковой кислотой [26]. Если продукты разрушения представляли собой частицы небольшого размера, они проникали через оболочку и высвобождались в раствор. Таким путем получали полые микрокапсулы со стенками из полиэлектро-
литных мультислоев, которые сохраняли форму, задаваемую исходной матрицей. При неполном растворении ядер из меламиноформальдегидных смол [35—37] или ядер, в состав которых дополнительно вводили полимеры, не способные проникнуть через оболочку, получали заполненные или "матриксные" микрокапсулы [38].
В качестве основного белка в технике ПАП часто используют протамин (М = 5 х 103, р1 10.5) [35, 37, 39, 40] и ингибитор протеаз апротинин (М = 6.5 х 103, р1 10.5) [41], заряженные положительно в широком интервале рН. Для формирования мультислоев из полипептидов применяют отрицательно заряженные полиглутаминовую и по-лиаспарагиновую кислоты и положительно заряженные полиаргинин и полилизин, обладающие, однако, высокой токсичностью [42]. Для устранения этого недостатка использовали генно-инженерный подход, позволяющий создавать новые полипептиды и белки с заданными свойствами. Так, были получены два эласт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.