ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 5, с. 476-482
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.552
БЕСФЕРМЕНТНЫЙ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ E. COLIС ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОКОМПОЗИТОВ Fe3O4 С ОБОЛОЧКОЙ SiO2, МОДИФИЦИРОВАННОЙ ФЕРРОЦЕНОМ
© 2015 г. А. Н. Козицина*, **, ^ Н. Н. Малышева*, **, И. А. Утепова*, ***, Ю. А. Глазырина*, **, А. И. Матерн*, Х. З. Брайнина*, ****, О. Н. Чупахин*, ***
*Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина, Химико-технологический институт 620000 Екатеринбург, ул. Мира, 19 **Уральский центр биофармацевтических технологий 624130 Свердловская обл., Новоуральск, ул. Подгорная, 11 1E-mail: a.n.kozitsina@ustu.ru ***Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения
Российской академии наук 620041 Екатеринбург, ул. С. Ковалевской, 20 ****Уральский государственный экономический университет
620144 Екатеринбург, ул. 8 Марта, 62 Поступила в редакцию 14.10.2013 г., после доработки 06.06.2014 г.
Разработан электрохимический метод иммуноанализа для определения бактерии Escherichia coli штамм ATCC 25922 с использованием электроактивных нанокомпозитных частиц на основе магнетита Fe304 с покрытием SiO2, модифицированным ферроценом, в качестве сигналообразующей метки. С использованием метода циклической вольтамперометрии получен чувствительный, прямой, легко измеряемый аналитический отклик. Разработанный метод позволяет определять минимальную концентрацию бактериальных клеток 2.3 х 103 КОЕ/мл. Интервал определяемых концентраций 2.3 х 103—2.3 х 107 КОЕ/мл, предел обнаружения составляет 2.5 х 102 КОЕ/мл. Необходимый объем пробы — 0.5 мл, продолжительность анализа 40 мин.
Ключевые слова: циклическая вольтамперометрия, иммуноанализ, электроактивные нанокомпо-зитные частицы.
Б01: 10.7868/80044450215050072
В связи с увеличением плотности населения проблема бактериального загрязнения биологических и природных объектов актуальна как в развитых странах, так и в особенности в странах "третьего мира". Быстрое обнаружение инфекционных агентов чрезвычайно важно для эффективной профилактики и лечения микробных инфекций. Если до недавнего времени анализ выполняли в основном в централизованных специализированных лабораториях, то сегодня все больше задач выносится за их пределы, непосредственно на места отбора проб. В связи с этим принципиальное значение приобретает создание и внедрение в практику высокопроизводительных и экспрессных методик определения бактериального загрязнения окружающей среды, а также выявления инфекций в биологических объектах.
Среди большого разнообразия бактерий, вызывающих инфекционные заболевания у людей и животных, одной из наиболее распространенных является Escherichia coli. Существует множество штаммов E. coli, среди которых встречаются как непатогенные и условно-патогенные, так и патогенные, вызывающие заболевания разной степени тяжести и приводящие к смерти пожилых людей, детей и лиц с ослабленным иммунитетом. Периодически происходят вспышки тяжелых инфекций, вызываемых патогенными штаммами (0104:H4, O157:H7). Однако из-за сходной внутривидовой физиологии E. coli для исследовательских целей в качестве модельной системы чаще всего используют непатогенные либо условно-патогенные штаммы.
В медицинской практике для идентификации и определения концентрации бактерий в различ-
ных объектах используют ставшие уже классическими методы бактериального посева (подсчет числа колониеобразующих клеток), полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) [1—3], твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) [4, 5], иммунной флуоресценции [6]. Однако эти методы имеют ряд недостатков. Так, основными недостатками метода бактериального посева являются его длительность и высокие требования к стерильности лаборатории. Диагностика с помощью метода иммунной флуоресценции требует высокой квалификации врача-лаборанта. Выявленные бактерии могут быть живыми или мертвыми (оставшиеся после лечения). Концентрацию антител, выработавшихся в ответ на попадание в организм инфекционного агента, определяют с использованием метода ИФА. Антитела (IgG) вырабатываются организмом в достаточной для определения концентрации спустя определенный промежуток времени после заражения, поэтому метод ИФА не пригоден для выявления заболевания на ранней стадии. Кроме того, метод ИФА требует применения нестабильных при хранении ферментов. Для проведения ПЦР анализов необходимо специальное дорогостоящее лабораторное оборудование и высококвалифицированный персонал. Существует вероятность получения ложноположительных результатов. Затрачиваемое время составляет от 3— 4 ч до суток. Существенным недостатком этих методов является использование их только в крупных медицинских центрах или специализированных лабораториях.
Таким образом, актуальна разработка новых высокочувствительных, экспрессных и экономичных методов определения различных бактерий. В последнее время появилось много публикаций, предлагающих новые варианты классических методов и подходов [7—9]. Несмотря на большое разнообразие, эти методы по способу детектирования можно разделить на визуальные (микроскопия и посев), оптические, электрические, термические, акустические. Одной из тенденций последнего десятилетия является использование при разработке методов обнаружения бактерий наноматериалов с их уникальными оптическими, электрохимическими и магнитными свойствами. Наноматериалы применяют для увеличения чувствительности и уменьшения продолжительности анализа, обнаружения инфекционных агентов в сложных средах, таких как кровь, моча, смывы [10—12]. Чаще всего, наноматериа-лы используют в иммуноанализе в качестве меток, а также при модификации трансдьюсеров и сенсоров для увеличения их проводимости [13]. Липосомы, нанотрубки, квантовые точки, нано-частицы металлов и их оксидов, полимерные на-ночастицы и нанокомпозиты [14] — наиболее часто встречающиеся примеры наноматериалов, применяемых при разработке новых методов диа-
гностики инфекционных заболеваний. Однако методы с применением наноматериалов в некоторых случаях требуют применения дорогих реактивов, которые сложно синтезировать, и/или нестабильных ферментов, флуоресцентных соединений. К недостаткам таких методов относятся большие временные затраты на проведение анализа/пробо-подготовку (методы основанные на принципах ПЦР и ИФА) [15—18], использование дорогого оборудования (оптические методы и метод пьезоэлектрического микровзвешивания) [19—32]. Разрабатываемые в настоящее время электрохимические методы определения инфекционных агентов [33, 34] хотя и не требуют применения дорогостоящего оборудования, зачастую основаны на использовании ферментов. Таким образом, можно заключить, что необходима разработка новых экспрессных, чувствительных и селективных методов и сенсоров, исключающих применение ферментов, для определения патогенных микроорганизмов, которые можно было бы использовать в небольших лабораториях. Сочетание преимуществ электрохимических методов и свойств наноматериалов позволит увеличить чувствительность и селективность и уменьшить продолжительность анализа.
Цель работы — разработка бесферментного метода электрохимического иммуноанализа с использованием нанокомпозитных частиц на основе наночастиц Ре304 с покрытием 8Ю2, модифицированным ферроценом, в качестве сигналообразую-щей метки. Использование наночастиц, обладающих магнитными свойствами, позволяет включить в процедуру анализа магнитную сепарацию и концентрирование, повысить его чувствительность, селективность и оперативность. Сочетание магнитных свойств Бе304 и покрытия 8Ю2, модифицированного ферроценом, дающего стабильный, хорошо выраженный электрохимический сигнал, позволит упростить, удешевить и ускорить процедуру определения патогенных микроорганизмов в биологических объектах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты и аппаратура. Использовали стерильный физиологический раствор (0.9% NaCl) НПП "ПанЭко"; KNO3 квалификации ос. ч., FeCl3 • • 6H2O, FeCl2 • 4H2O, тетраэтоксисилан (Sigma-Al-drich), 25%-ный водный раствор NH3 квалификации ч. д. а. (OOO "Сигма ТЕК"), ферроценкарбо-новую кислоту, этанол 95%-ный (ООО "Гиппократ"), толуол (Sigma-Aldrich), бактерии Escherichia coli штамм ATCC 25922 (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск); Salmonella thyphimurium штамм SL7207 (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск); поликлональные антитела к бактерии Escherichia coli штамм ATCC 25922 (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск). Деионизованную воду для
^Fejo^ V SiO2 V
o
О о
Л Fe
N H
4Si(OEt)3
4 I + Fe
Рис. 1. Схема синтеза нанокомпозитных частиц.
приготовления растворов получали на комбинированной мембранной установке серии ДВС-М/1НА(18)-Ы (Медиана-Фильтр, Москва).
Для получения суспензий нанокомпозитных частиц использовали ультразвуковой гомогенизатор с микропроцессорным управлением Ultrasonic processor 500W (Sigma-Aldrich, США). Для проведения стадий конъюгирования бактериальных клеток и нанокомпозитных частиц и стадии образования иммунокомплекса меченая бактерия-антитело использовали инкубатор GFL type 1010. Для синтеза наночастиц и нанокомпозитов использовали мешалку магнитную с подогревом C-MAG HS 7 IKAMAG (IKA, Германия), верхнеприводную мешалку IKA Eurostar digital 2482000 (IKA, Германия) и магнитный штатив Magne-Sphere® для 12 микропробирок EppendorfT (Promega, США) с напряженностью магнитного поля 31.83 х 103 А/м.
Электрохимические исследования проводили с помощью потенциостата/гальваностата ^Auto-lab type III fra 2 (Metrohm, Швейцария). Транс-дьюсером служил толстопленочный графитсо-держащий электрод (ТГЭ), электродом сравнения и вспомогательным - насыщенный Ag/AgCl электрод (Metrohm, Швейцария) и стеклоугле-родный стержень (Metrohm, Швейцария) соответственно. Для всех измерений в качестве фонового электролита использовали 0.1 М водный раствор KNO3. Вольтамперограммы регистрировали при скорости развертки потенциала 250 мВ/с.
Количество электричества (Q), затраченное на электрохимический процесс, рассчитывали по площади под вольт-амперной кривой с применением программного обеспечения Nova 1.10, поставляемого в комплекте с потенциоста
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.