ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 4, с. 411-417
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543:645.9/544.3
БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ Р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРНЫХ МОДУЛЯТОРОВ В ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ
© 2015 г. А. А. Самосорова*, 1, Ю. А. Ефимова*, И. В. Рыбальченко**
*Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова
119571 Москва, просп. Вернадского, 86 1Е-таИ: alter_idem@bk.ru **27Научный центр Министерства обороны Российской Федерации 105005 Москва, Бригадирский переулок, 13 Поступила в редакцию 12.11.2013 г., после доработки 09.07.2014 г.
Представлены результаты сравнительного исследования способов получения производных при определении Р-блокаторов и Р-агонистов методом газовой хромато-масс-спектрометрии. Эффективность наилучшего способа подтверждена на примере ГХ—МС анализа смеси 13 Р-адренорецеп-торных модуляторов после получения соответствующих бифункциональных производных.
Ключевые слова: газовая хромато-масс-спектрометрия, Р-адренорецепторные модуляторы, Р-бло-каторы, Р-агонисты, получение бифункциональных производных.
Б01: 10.7868/80044450215040192
Р-Блокаторы (ББ) и Р-агонисты (БА), составляющие группу Р-адренорецепторных модуляторов (БАМ), широко применяют в практике лечения сердечно-сосудистых заболеваний и астмы, поэтому активные компоненты лекарственных препаратов следует постоянно контролировать. ББ и БА также применяют спортсмены в качестве допинга, в связи с чем их содержание в биожидкостях по требованиям Всемирного антидопингового агентства подлежит периодическому контролю [1]. Ввиду довольно высокой токсичности [2] и опасности передозировки данных препаратов нередки случаи отравления и даже летальных исходов после приема БАМ, что обусловило включение их в объекты исследования судебной химии. Отличительной чертой БАМ является присутствие в их молекулярных структурах группы —СИ(ОИ)СИ2МИ—, связанной с бензольным кольцом, и различных других заместителей в бензольном кольце и аминогруппе (рис. 1).
Для определения ББ и БА используют методы иммуноферментного анализа, газовой хроматографии, ВЭЖХ; пределы обнаружения веществ в биоматрицах должны быть не выше п нг/мл пробы. Наиболее предпочтительным является метод газовой хроматографии с масс-спектрометриче-ским детектированием (ГХ—МС), принятый в качестве арбитражного [3].
БАМ обладают целым рядом свойств, которые позволяют осуществлять их выделение из матрицы [4—6]: так, липофильные свойства БАМ изменяются в широком интервале (1§Р в пределах от 0.32 до 4.0), рКа8 ~ 9.2, молекулярные массы близки и варьируют в диапазоне ~250—400 а. е. м. Для выделения БАМ из биоматриц используют различные варианты экстракции: жидкостно-жидкост-ную (ЖЖЭ), твердофазную (ТФЭ), твердофазную микроэкстракцию (ТФМЭ) [7—9]. Обычно предпочтение отдают ТФЭ или ТФМЭ.
При исследовании сложных многокомпонентных биологических объектов селективное определение БАМ на уровне п нг/мл возможно исключительно с применением хроматографических методов. Ввиду полярности молекул БАМ при использовании газовой хроматографии требуется предварительная дериватизация [10]. Подбор подходящего реагента(-ов) является сложной задачей, поскольку при дериватизации необходимо учитывать множество факторов [11—13]. Так, например, реакция силилирования в основном протекает по гидроксильной группе, но обратимо протекает и по аминогруппе, поэтому для блокирования аминогруппы целесообразно проводить ацилирование.
При исследовании БАМ как правило применяют либо силилирование по гидроксильной группе с применением силилирующих реагентов,
к н к л
и о
О
к<
X
к £ К К
н,с
у.
сн,
н,с
]чгн
он
он
НзС^сНз
]чгн
сн,
но ^ он
Тербуталин
,сн2
сн,
он
Сальбутамол
а1 " I "
Ш СНз
он
Алпренолол
О
ОН
Атенолол
Н9К
НО
СНз
Пиндолол
Лабеталол
,8Ч
N N
Н,С Т^Н
N О-
О
11(1 НК-
Тимолол
СН3
—СН3
СН3
ОН
Пропранолол
]ЧГН
СНз
С1 Н3С^СНз Кленбутерол
]ЧГН
О
СНз
I
н,с КН^О он
Бетаксолол
СН3
НзС^К^^О Н ОН
о.
о
,о^сн3
СНз
НзС
.о.
Бисопролол
СНз
О
ОН
N СНз Н
Метопролол
ю
£ £
о о о та О
а
>
К
й тз
ОН
1Ш ^сн
Н3С кн сн3 н г А
нзс СН
Соталол
НзС
ОН
Надолол
Рис. 1. Графические формулы представителей БАМ.
например, М-метил-М- (триметилсилил)трифто -рацетамида (МСТФА) либо ацилирование по вторичной аминогруппе с использованием таких реагентов как М-метил-бис(трифторацетамид) (МБТФА), реже применяются пентафторпропио-новый (ПФПА) или гептафтормасляный (ГФМА) ангидриды [14]. Данные по сравнительной оценке эффективности различных способов получения перечисленных производных являются неполными, зачастую противоречивыми и относятся лишь к применению отдельных реагентов силилирующего или ацилирующего действия [15-18].
По нашему мнению блокирование обеих полярных групп должно приводить к получению более летучих производных. Кроме того, образование производных с большей молекулярной массой обусловливает их масс-фрагментацию с генерацией объемных характерных фрагментарных ионов. Все это должно привести к повышению селективности и чувствительности определения БАМ.
Цель настоящей работы — исследование возможности получения бифункциональных производных из БАМ, выделенных из образцов мочи по приведенной ниже схеме, с последующим анализом пробы.
R
-R
NH
OH
МСТФА R1
(CH3)3Si-O
Ri
МБТФ
N
о
-R,
(CH3)3Si O CF3
/R,'
N ПФМА
H "
ГФМА
Ri
N'
-R
-2
(CH3)3Si^ о' CF3
Ri
N
'O
(CH3)3Si O c3f7 Схема бифункциональной дериватизации БАМ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследование проводили с использованием следующих реактивов: метопролола тартрата, аце-бутолола гидрохлорида, бетаксолола гидрохлорида, пропранолола гидрохлорида, алпренолола гидрохлорида, пиндолола, надолола, лабеталола гидрохлорида, соталола гидрохлорида, бисопролола, тимолола, кленбутерола гидрохлорида, сальбута-мола, тербуталина гидрохлорида, а также дерива-тизирующих реагентов: МСТФА, МБТФА, ПФПА и ГФМА. Все реактивы производства Sigma— Aldrich (США), не менее 99.0% чистоты. Использовали органические растворители: метанол, трет--бутилметиловый эфир (МТБЭ) не менее 99.8% чистоты (Merck, США).
Анализы осуществляли на оборудовании, оснащенном автосамплером Agilent 7693 Au-tosampler, газовом хроматографе Agilent 7890А c квадрупольным масс-селективным детектором Agilent 5975C. Разделение проводили на капиллярной колонке DB-5MS (JW Scientific, Courta-boeuf, France) длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм, толщиной слоя неподвижной фазы 0.25 мкм. Температура инжектора 250°C. Пробу объемом 1 мкл вводили в режиме без деления потока при постоянном расходе газа-носителя гелия 40 см/с (1.2 мл/мин), чистота которого составляет 99.9999% и соответствует гелию высокой чистоты марки 6.0 (ТУ 0271-001-45905715-02, НПО "Ге-
лиймаш"). Дополнительную очистку гелия от азота, кислорода, углекислого газа и других примесей осуществляли путем пропускания через селективные сорбционные фильтры.
Начальная температура колонки составляла 160°C (1 мин), градиентный нагрев 20 град/мин до 250°C (2 мин), градиентный нагрев 10 град/мин до 300°C (5 мин). Температура детектора 280°C. ГХ—МС определение выполняли в режиме полного сканирования масс в диапазоне 34—800 а. е. м. и в режиме выбранных ионов.
Подготовка стандартных растворов. Растворы БАМ и их смеси готовили растворением 1 мг каждого компонента в 1 мл метанола, содержание веществ в пробе мочи не превышало 500 нг/мл.
Для приготовления матрицы отбирали несколько образцов мочи мужчин, не принимавших лекарственных и других препаратов. Данные фракции объединяли в одну среднюю пробу, в которую затем добавляли стандарты.
Подготовка пробы мочи. Исходный образец мочи с внесенными БАМ объемом 2.5 мл гидро-лизовали в течение 3 ч при 55°C в мягких условиях с добавлением 50 мкл глюкуронидазы Helix Pomatia в присутствии 50 мкл 2 M ацетатного буферного раствора, pH 5.2. Образец охлаждали, затем проводили ЖЖЭ с использованием 2.5 мл МТБЭ. Смесь перемешивали в течение 5 мин,
414
САМОСОРОВА и др.
I х 10 4, отн. ед. 16 14 12 10 8 6 4 2 0
у = 7606.5* + 340.16 й2 = 0.9994
у = 4935х + 754.47 й2 = 0.9999 у = 3580.7* + 140.33 й2 = 0.9998
у = 2617.3* + 220.17 й2 = 0.9999
17 19 21 с, нг/мл
Рис. 2. Градуировочные графики для определения ТМС (1), ТМС-ТФА (2), ТМС-ПФПА (3) и ТМС-ГФМА (4) производных кленбутерола.
затем центрифугировали в течение 5 мин со скоростью вращения 6000 об/мин. Экстракт отделяли, доводили рН мочи до 9.5 добавлением №ИС03/К2С03 буферного раствора и проводили однократную ТФЭ на С18 картридже емк. 500 мг/3 мл. Экстракты объединяли, обезвоживали над безводным Na2S04 и упаривали досуха в токе азота при 40°С.
Дериватизация. Силилирование. В ходе силили-рования к сухому остатку добавляли 50 мкл МСТФА, активированного йодидом аммония и этантиолом в соотношении 1000 : 2 : 2 (по объему), полученную смесь перемешивали при 60°С в течение 30 мин. Образовавшиеся триметилсилил (ТМС) производные определяли методом ГХ-МС.
(а)
х
13
о
о н
<ч
и
о
н те
н
8
27 25 23 21 19 17 15 13 11 9 7 5 3 1
21 19 17 15 13 11 9 7 5 3 1
10
(б)
1 2 3 4 5 6 7 \
/
9 10 11 12 13
X
-г
10 11 Время, мин
6
7
8
9
6
7
8
9
Рис. 3. Разделение ТМС (а) и ТМС-ТФА (б) основных продуктов дериватизации БАМ по полному ионному току.
ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 70 № 4 2015
Таблица 1. Времена удерживания, аналитическая форма соединения, его молекулярная масса, выход продукта и предел обнаружения ТМС-производных БАМ
№ пика на рис. 4 Время удерживания, мин Аналитическая форма соединения M, г/моль Степень конверсии, % нг/мл
1 6.13 Тербуталин—3ТМС 441 100 5.0
2 6.62 Сальбутамол—3ТМС 455 100 1.2
3 6.65 Метопролол—ТМС 339 82.4 1.3
4 6.66 Алпренолол—2ТМС 394 78.1 2.2
5 6.78 Кленбутерол—2ТМС 422 100 1.2
6 7.23 Пропранолол—ТМС 332 83.3 1.8
7 7.42 Бисопролол-2ТМС-и-пр* 428 64.9 10
8 7.65 Соталол—2ТМС 417 72.3 0.6
9 7.75 Пиндолол—ТМС 321 50.3 11
10 7.82 Тимолол—ТМС 461 100 0.3
11 8.13 Бетаксолол—2ТМС 452 53.2 8.3
12 8.71 Надолол—3ТМС 525 100 2.2
13 9.01 Ацебутолол—3ТМС 553 80.6 5.4
* "и-пр" — видоизменение продукта происходит посредство
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.