ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 413, № 3, с. 360-362
ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ
УДК 666.3-127; 546.41
БИОАКТИВНАЯ КОМПОЗИЦИОННАЯ КЕРАМИКА В СИСТЕМЕ ГИДРОКСИАПАТИТ-ТРИКАЛЬЦИЙФОСФАТ
© 2007 г. О. Л. Кубарев, В. С. Комлев, М. Майтц, С. М. Баринов
Представлено академиком К.А. Солнцевым 11.09.2006 г. Поступило 15.09.2006 г.
Синтетические материалы на основе гидрок-сиапатита (ГА) - аналога минеральной составляющей костной ткани - находят применение в медицине для реконструкции поврежденных костных тканей [1-3]. Новые технологии реконструкции основаны на имплантировании в костную ткань пористых керамических матриксов с культивированными в них клетками и протеинами [4]. Формирование новой костной ткани - сложный процесс, важной стадией которого является адсорбция протеинов [5, 6]. Матриксы должны быть резорбируемы во времени в организме человека, с постепенным их замещением новообра-зующейся костной тканью, и обеспечивать высокую способность адсорбировать протеины. ГА устойчив к растворению жидкостями организма, тогда как трикальцийфосфат (ТКФ) имеет существенно более высокую скорость резорбции по сравнению с таковой у ГА, и, варьируя соотношение компонентов в композиционных материалах ГА-ТКФ, можно управлять скоростью резорбции. Проблема разработки таких композиционных материалов рассмотрена в обзорах [7, 8]. Би-фазные композиты (БКМ) получают термическим разложением кальцийдефицитного ГА с последующим спеканием [8]. Данным методом трудно контролировать соотношение компонентов в материале. Остаются невыясненными также некоторые аспекты влияния фазового состава на биологическое поведение БКМ. Настоящая работа посвящена исследованию технологии БКМ с заданными составом и пористостью, а также выяснению в экспериментах in vitro вопроса о том, какой из факторов - пористость или фазовый состав - является доминирующим для адсорбции протеинов.
Институт физико-химических проблем керамических материалов Российской Академии наук, Москва Исследовательский центр Россендорф, Германия
Гидроксиапатит синтезировали методом гете-рофазного взаимодействия в соответствии с реакцией
ЮСаО + 6 (КИ4 )2НР04 + 4Н20 —» —> Са10(Р04)6(ОН)2 + 12КН40Н. (1)
Исходные твердые оксид кальция и кислый фосфат аммония в количествах, соответствующих реакции (1), смешивали в планетарной мельнице 30 мин, затем добавляли дистиллированную воду при дальнейшем перемешивании в течение 30 мин; продукт реакции сушили в микроволновой печи и подвергали термообработке 1 ч при 900°С на воздухе. Средний размер частиц (агломератов) порошка ГА по данным атомно-силовой микроскопии составил 1.9 мкм. Порошки в-ТКФ получали осаждением из раствора по реакции
3Са( N03 )2 + 2 (КН4 )2НР04 + 2КН40Н —»
—> Са3 (Р04 )2 + 6NH4N03 + 2Н20. (2)
Водный 6М раствор фосфата аммония медленно, при перемешивании лопастной мешалкой приливали к 1М раствору нитрата при 60°С. Значение рН поддерживали на уровне около 7 добавлением аммиака. После старения осадок отфильтровывали на воронке Бюхнера, промывали дистиллированной водой и подвергали термообработке на воздухе при 950°С в течение 1 ч. Средний размер частиц порошка 7.2 мкм.
Согласно данным рентгеновского фазового анализа (РФА, дифрактометр Shimadzu XRD-6000, излучение Си Ка) продукты синтеза идентифицированы как ГА и в-ТКФ соответственно. Затем готовили смеси порошков в заданных количествах, вводили пластификатор (2%-ный раствор поливинилбутираля в этаноле), смеси гранулировали, подвергали одноосному прессованию под давлением 230 МПа и спекали при температуре в интервале 1100-1300°С (в зависимости от состава шихты и требуемой пористости керамики) на воздухе в течение 2 ч. Фазовый состав спеченных образцов керамики определяли методом РФА с использованием калибровочных зависимостей
БИОАКТИВНАЯ КОМПОЗИЦИОННАЯ КЕРАМИКА
361
(погрешность анализа ± 3 мае. %). Пористость измеряли методом гидростатического взвешивания.
Адсорбцию протеинов оценивали методом ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, подробно описан в работах [9, 10]) по результатам измерения оптической плотности на приборе BioTek. Исследовали адсорбцию фибронектина и морфогенетического протеина БМП-2, которые играют важнейшую роль в процессе остеогенеза: фибронектин, адсорбированный на поверхности матрикса, определяет процессы адгезии клеток, взаимодействуя с рецепторами; БМП-2 влияет на процессы дифференцировки клеток в остеообра-зующие [11]. Образцы в форме дисков с площадью поверхности около 10-4 м2 окунали в суспензии протеинов. Концентрации суспензий 5 мкг/мл и 0.5 мкг/мл соответственно. Использовали антитела FN-15 ("Sigma") и БМП 2/4 ("R&D Systems") в буферном физиологическом хлоридно-фосфат-ном растворе PBS для фибронектина и протеина БМП-2 соответственно; обработка энзимами (щелочная фосфатаза) обеспечивала получение сигнала флуоресценции, регистрируемого прибором BioTek.
Данные по открытой пористости и фазовому составу спеченной керамики приведены в табл. 1. На рис. 1 показана микроструктура плотно спеченной и пористой керамик по данным атомно-силовой микроскопии. Разработанная технология позволяет получать плотно спеченные (открытая пористость ниже 1%) и пористые композиционные материалы с соотношением ГА/ТКФ от 0 до 1. Растворимость композиционных бифазных материалов, изученная на гранулах, изменяется в широких пределах, возрастая с увеличением содержания ТКФ в БКМ [12]. На рис. 2 приведены гистограммы адсорбции фибронектина и морфогенетического
Таблица 1. Открытая пористость и фазовый состав керамики
Образец Открытая пористость, % Фазовый состав, мас. %
1 1.0 ГА 100
2 0.9 ГА 95, ß-ТКФ 5
3 1.0 ß-ТКФ 25, а-ТКФ 70, Са2Р2О7 5
4 20.2 ß-ТКФ 30, а-ТКФ 70
5 20.5 ß-ТКФ 90, ГА 10
6 19.8 ß-ТКФ 85, ГА 15
протеина БМП-2 на образцах плотно спеченной и пористой керамики разного фазового состава (данные нормализованы на адсорбцию протеинов на чистом ГА). Из сопоставления данных для образцов 1-3 плотной керамики следует, что ТКФ-ке-рамика обладает в 3-5 раз более высокой способностью к адсорбции протеинов, чем ГА-керамика. Сравнение данных, полученных для образцов пористой и плотной керамик, например, для образцов 4 и 3 (ТКФ-керамика), а также для образцов 4-6 пористой керамики с разным содержанием ГА, приводит к мнению, что открытая пористость 20% увеличивает адсорбцию протеинов примерно в 4 раза.
Таким образом, разработанная технология БКМ может быть использована в медицине для изготовления биологически активных керамических изделий различного назначения: от несущих нагрузку имплантатов до пористых матриксов для клеточных технологий восстановления костных тканей, обладающих контролируемой скоростью растворения внеклеточными жидкостями
(а)
(б)
10
мкм
Рис. 1. Атомно-силовая микроскопия поверхности керамики образцов 1 (а) и 5 (б). ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 413 < 3 2007
362
КУБАРЕВ и др.
Относительная адсорбция
14 (а)
12
10
8 6 4 2 0
1 2 3 4 5 6 Номер образца
Рис. 2. Гистограммы адсорбции фибронектина (а) и морфогенетического протеина БМП-2 (б), приведенной к адсорбции протеинов на плотно спеченной ГА-керамике.
организма и высокой способностью к адсорбции протеинов.
ВЫВОДЫ
Разработан метод изготовления бифазной керамики ГА-ТКФ, основанный на раздельном синтезе и смешении порошков компонентов в заданных соотношениях с последующим спеканием. Метод позволяет с высокой воспроизводимостью контролировать фазовый состав и пористость материала. Биохимическими испытаниями установлено, что как фазовый состав, так и пористость существенно влияют на адсорбцию протеинов на бифазной керамике: адсорбция повышается с увеличением содержания ТКФ и с повышением пористости керамики.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 06-03-32192 и 06-03-08028, офи), а также в рамках проекта международного сотрудничества с Исследовательским центром Россен-дорф, поддержанного грантом WTZ (Германия).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вересов А.Г., Путляев В.И, Третьяков Ю.Д. // Рос. хим. журн. 2000. Т. 44. № 6. С. 32-46.
2. Hench L.L. // J. Amer. Ceram. Soc. 1991. V. 74. P. 1487-1510.
3. Баранов C.M., Комлев В С. Биокерамика на основе фосфатов кальция. М.: Наука, 2005. 205 с.
4. Hench L.L, Polak J.M. // Science. 2002. V. 295. P. 1014-1017.
5. Ducheyene P, Qui Q. // Biomaterials. 1999. V. 20. P. 2287-2303.
6. Combes C, Ray C. // Biomaterials. 2002. V. 23. P. 2817-2823.
7. Daculsi G, Laboux O, Malard O, Weiss P. // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2003. V. 14. P. 195-200.
8. LeGeros R.Z, Lin S, Rohanizaden R. et al. // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2003. V. 14. P. 201-209.
9. Engvall E, Perlman P. // Immunochemistry. 1971. V. 8. P. 871-874.
10. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne DA, Kuby J. In.: Immunology. N.Y.: Freeman, 2003. P. 148-150.
11. Anderson J.M, Bonfield T.L, Ziats N.P. // Intern. J. Ar-tif. Organs. 1990. V. 13. P. 375-382.
12. Кубарев О.Л., Комлев В С, Баранов C.M. а др. // ДАН. 2006. Т. 409. № 1. С. 73-76.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 413 < 3 2007
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.